Notch信号转导通路在骨形成和重建中的调节作用*

杨 冰 周 慧 樊飞跃 孙元明

骨重建是一个持续不断的骨组织吸收以及骨形成的过程。骨形成由源自间质干细胞的成骨细胞完成[1]，而骨吸收则由来自多能造血干细胞的破骨细胞完成[2]。破骨细胞一般在3～5周内完成重建单元中的骨吸收，而成骨细胞则要用3～5个月的时间对基质进行矿化以完成骨的重建。骨形态发生蛋白（BMPs）[3]以及Wnt信号转导通路[4]对间质干细胞向成骨细胞的分化有着调节作用。Notch信号转导通路与BMPs、Wnt相互作用对成骨细胞起调节作用。在破骨细胞中，Notch通路通过核因子NF-κB受体激活因子配体（Receptor Activa⁃tor of NF-κB Ligand,RANKL）/核因子NF-κB受体激活因子（Receptor Activator of NF-κB,RANK）/骨保护素（Osteoprotey⁃erin,OPG）系统进行调节[5]。Notch信号转导通路对骨形成、骨细胞的存活及骨重建起关键作用。

1 Notch信号转导通路

Notch信号转导通路在进化中高度保守，在细胞的生长、分化及生存方面起重要作用。Notch信号转导通路最早发现于果蝇，Notch失活导致果蝇翅膀上产生缺口。在哺乳动物中，Notch信号转导通路有4种受体（Notch1、2、3、4）和5种配体（Jagged1、2，Delta 1、3、4）。这些配体和受体都是单跨膜蛋白，需要细胞之间的相互接触才能激活。当相邻细胞的Notch配体与受体结合后，Notch受体的胞外部分会被肿瘤坏死因子（TNF）-α转化酶酶切，酶切后产生不稳定的过度多肽，后者被γ-分泌酶复合体识别并进一步将Notch受体的胞内部分酶切，产生具有活性的Notch胞内结构域（notch intra⁃cellular domain,NICD）。γ-分泌酶复合体是由Presenilin（PS）蛋白酶1、2以及调节组件Presenilin Enhancer 2（PEN2）、An⁃terior pharynx defective 1（Aph1）和Nicastrin（NCT）组成的[6]。在没有NICD存在的情况下，CSL（在人为CBF1，在鼠为RBPJ在果蝇为Suppressor of hairless，在线虫为Lag1）和带有组蛋白去乙酰复合物（histone deacetylase complexes，HDAC）的共同抑制蛋白一起与DNA相结合抑制转录。γ-分泌酶复合体酶切产物NICD可以进入细胞核将共同抑制蛋白置换下来，并与CSL及Mastermind-Like（MAML）蛋白形成三元复合体，将CSL蛋白由原来的转录抑制作用转换为激活作用[7]。在经典的Notch信号转导通路中，被转录的基因有Hairy Enhancer of Split（HES）1、HES5、HES6、HES7、HES-related with YRPF mo⁃tif（HEY）1、HEY2及HEYL。

2 Notch信号转导通路在骨发育及骨重建中的作用

2.1 Notch信号转导通路对软骨内骨形成的影响 在骨发育过程中，间质干细胞分化为软骨细胞而形成透明软骨，随后透明软骨内的软骨细胞变肥大、矿化并最终凋亡。在此过程中，血管进入软骨中，进而使骨细胞前体继续完成软骨内成骨的过程。

Notch信号转导通路对软骨的形成有抑制作用。Grogan等[8]研究表明Notch通路下游产物HES1以及HEY1可以与DNA序列中临近SOX9增强子识别位点的序列相结合，从而抑制软骨细胞特异性胶原蛋白Ⅱα(Ⅰ)启动子的活性。Mead等[9]研究表明在小鼠体内增强Notch信号转导通路的活性可对软骨细胞的分化和矿化起抑制作用。Hilton等[10]研究发现条件性敲除PS1并且伴随PS2失活导致Notch蛋白不能被酶切从而使信号转导受到阻碍后，肥厚软骨细胞发生聚集可导致严重的骨骼畸形；同时敲除Notch1和Notch2的小鼠也表现出了同样的表型，从而证明PS1和PS2失活而出现的表型也是由于Notch信号转导缺失造成的；仅条件性敲除Notch2后也出现了与同时敲除Notch1和Notch2后的表型，说明Notch2蛋白在软骨内骨形成的调节中起主导作用。

2.2 Notch信号转导通路对成骨细胞分化及功能的影响 在体外研究中，Notch信号转导通路对间质干细胞前体向成骨细胞分化既有激活也有抑制作用。小鼠的体内研究有利于认识Notch信号转导通路作用。Engin等[11]研究表明NICD的表达置于在2.3 kb胶原Ⅰ型启动子控制之下的转基因小鼠由于成骨细胞未成熟或功能紊乱导致骨量增加及生长迟缓。而Zanotti等[12]研究则表明将NICD的表达置于在3.6 kb胶原Ⅰ型启动子控制之下的转基因小鼠由于成骨细胞数量的减少导致骨量的下降。这2种不同的表型是由于2.3 kb和3.6 kb胶原Ⅰ型启动子分别导致了成骨细胞停留在向成熟成骨细胞分化的不同阶段。NICD的表达置于在2.3 kb胶原Ⅰ型启动子控制之下抑制了成骨细胞分化的终末阶段致使形成了较多的未成熟或功能紊乱的成骨细胞[11]。而在3.6 kb胶原Ⅰ型启动子控制之下表达的NICD，则在成骨细胞分化早期发挥了抑制作用，从而导致成熟成骨细胞数量的下降[12]。Notch信号转导通路并不是通过影响成熟成骨细胞功能来发挥其调节作用的，而是通过调节其前体的分化来发挥作用。Hilton等[10]研究表明Notch信号转导通路可以使间质干细胞前体保持于未分化的状态，而不分化为成熟成骨细胞。

BMPs是转化生长因子（transforming growth factor,TGF）超家族的成员，其对成骨细胞的分化起重要作用[13]。Notch信号转导通路在BMP-2诱导的成骨细胞分化中起重要作用。有研究发现，通过使Delta1和Jagged1在MC3T3-E1细胞中过表达，并不能直接引起成骨细胞分化上的变化，而是增强了BMP-2诱导的成骨细胞分化作用[14]。

Wnt蛋白是36～46 ku富含半胱氨酸的分泌糖蛋白，在成骨细胞的调节中起重要作用[15]。Deregowski等[16]研究表明NICD过表达抑制了Wnt/β-catenin信号转导通路从而抑制了成骨细胞的分化。

2.3 Notch信号转导通路对破骨细胞分化及功能的影响 破骨细胞是来源于单核-巨噬细胞系具有骨吸收作用的多核细胞。破骨细胞的分化和激活是由成骨细胞或骨髓基质细胞进行调控的。RANKL和巨噬细胞集落刺激因子（macro⁃phage colony-stimulating factor,M-CSF）对破骨细胞的发育至关重要。RANKL是TNF家族的成员，其表达受一系列骨吸收因子包括1,25-二羟基维生素D3、白细胞介素-1（IL-1）、甲状旁腺激素相关多肽（parathyroid hormone-related peptide, PTHrP）以及TNF-α的调控。M-CSF可以诱导单核-巨噬破骨细胞前体细胞的增殖和存活，而RANKL与其受体RANK相结合促进破骨细胞前体的分化与成熟。OPG是一种可溶性的伪受体，其可以与RANKL结合但并没有促进破骨细胞前体的作用。RANKL与OPG都在骨基质细胞和成骨细胞上表达，其比例对调节破骨细胞活性非常重要[17]。

Notch信号转导通路对于破骨细胞前体的分化具有抑制作用[11,18]。Bai等[18]研究表明体外敲除骨基质巨噬细胞中的Notch1、Notch2、Notch3可以促进破骨细胞前体的增殖与分化；破骨细胞中的Notch1失活会抑制其OPG的表达，进而促进破骨细胞的分化与骨吸收能力，从而证明Notch信号转导通路对破骨细胞具有抑制作用。Fukushima等[19]研究表明在破骨细胞前体中诱导Notch2的表达可提高nuclear factor of activated T cell c1（NFATc1）启动子的活性，增强RANK诱导的破骨细胞生成作用。这表明在特定条件下，Notch2可以促进破骨细胞的生成。在成骨细胞对破骨细胞调节作用方面：Notch信号转导通路通过促进成骨细胞OPG的表达，从而减弱RANK通路介导的破骨细胞分化作用[20]。Bai等[18]研究表明破骨细胞上表达有Notch配体(Delta1，Jagged1和Jagged2),将成骨细胞上的Notch1敲除后，由于OPG表达的降低可引起破骨细胞数量的增加。

综上所述，Notch信号转导通路对软骨、成骨细胞、破骨细胞的分化起到了重要的调节作用。Notch信号转导通路调节失调可以导致骨发育失调、骨肉瘤等疾病[21]。对于Notch通路在整个成骨细胞成熟过程中起的调节作用以及其对维持骨组织稳态中的作用目前还不是很清楚。在以后的研究中可以采用敲除或者激活Notch信号通路中的关键信号分子以及其他手段深入研究。

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