中药多糖的分离纯化方法研究进展*

张 岩,马丽娜,陶遵威

(1.天津中医药大学,天津 300073； 2.天津市医药科学研究所,天津 300020)

多糖(polysaccharides,PS),是一类天然高分子化合物,是由醛糖或酮糖通过苷链连接在一起的聚合度超过10的多聚物,在生物体内作为能量物质,存在于一切细胞膜结构中,参与细胞的各种生理活动,是维持生命活动正常运转的基本物质之一。多糖也是中药活性成分之一,具有许多药理活性和药效功能[1-3],在免疫调节、抗肿瘤、抗凝血、降血糖、降血脂、抗辐射、抗菌、抗感染、抗病毒、保护肝脏和抗衰老等方面具有独特的功效,而且多糖来源广泛且无毒,具有较高的开发价值。因此,对中药多糖的研究开发,越来越引起国内外科研工作者的兴趣,并成为当前的研究热点。在我国,中药多糖研究近几年发展得非常迅速,但多糖的分离纯化以及分析方法基于效率和成本等多方面的考虑,尚无公认、有效、统一的模式,运用各种分离纯化方法对不同植物多糖的开发、比较和分析,仍是研究工作的焦点之一。因此,本文就近年来有关中药多糖的分离纯化方法做一概述,以期为多糖的相关研究及进一步开发利用提供参考。

1 多糖的分离纯化

从中草药中提取的粗多糖,一般含有许多杂质,主要有无机盐、单糖、寡糖、低分子量的非极性物质及高分子量的有机杂质，需进一步除去杂质、分离并进行精制,方可进行下一步的研究。通常的步骤是先将极性差异较大的组分进行分离；再经过除蛋白、脱色等处理；然后进一步将多糖按不同相对分子质量进行分级。具体的方法根据中草药的性质不同而异。

1.1超滤膜分离法 超滤(UF)是一种膜分离技术,所采用的超滤膜能够从水和其他液体中分离出很小的胶体和大分子。将超滤膜用于多糖这种生物活性物质的分离,具有不损害活性、分离效率高、能耗低、设备简单、可连续生产、无污染等优点,在多糖分离方面具有广阔的应用前景[4,5]。李燕妮[6]探索了超滤法分离纯化刺参酸性黏多糖的工艺。确定分离纯化条件为:采用截留分子量8 kDa的超滤膜,压力为0.3 MPa,温度为10℃。此工艺制得多糖纯度为93.4%,收率为0.32%,多糖截留率达到97.2%。王子尧等[7]采用切向流超滤技术分离丹皮多糖的截留率达到92.91%,多糖制品的纯度达到84.2%,说明超滤是分离浓缩丹皮多糖的有效手段之一。Marnoch R 等[8]还应用超滤法纯化了芥子蛋白。

1.2沉淀分离法 包括分步沉淀法和季铵盐沉淀法。分步沉淀法根据多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度的性质,逐次按比例由小到大加入这些醇或酮(常用的是甲醇、乙醇和丙酮)将不同相对分子质量的多糖分别沉淀出来[9]。这种方法适宜于分离各种溶解度相差较大的多糖。闫巧娟等[10]用不同浓度乙醇沉淀黄芪水提液的方法获得了黄芪多糖的不同相对分子质量分布情况。此方法可结合动物实验用于考查不同相对分子质量多糖的生物活性。季铵盐沉淀法根据长链季铵盐能与酸性多糖成盐,形成水不溶性多糖化合物的特性,常用于酸性多糖的分离。当溶液的pH值增高或加入硼砂缓冲液使糖的酸度增高,也会与中性多糖形成沉淀。常用的季铵盐是十六烷基三甲基铵溴化物(CTAB)及其碱(CTA-OH)和十六烷基呲啶(CPC),其浓度一般为 1%～10%(W/V),其可在酸性、中性、微碱性或碱性中分级沉淀分离出酸性多糖[11]。陈海华等[12]采用CTAB络合法分离得到酸性多糖(AFM)和中性多糖(NFM)粗制品。李宏燕等[13]经正交试验优选出大枣多糖纯化工艺体积比为1∶1加入2%(W/V)的 CTAB，35℃下保温静置4h。

1.3柱色谱法 根据柱填料的不同,柱色谱法既可用于多糖与其他极性差异较大组分的分离,也可用于多糖的脱色与分级。常用的柱层析方法有凝胶柱层析、阴离子交换柱层析和大孔树脂柱层析。

1.3.1凝胶柱层析法 凝胶色谱利用分子筛原理,根据被分离物质分子的大小和形状不同而达到分离目的。常用的凝胶有葡聚糖凝胶(sephadex)和琼脂糖凝胶(sepharose),以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂,使各种多糖得以分离纯化,但不适宜黏多糖的分离。张体祥等[14]用Sephadex G-100凝胶柱层析对板蓝根多糖进行分离,得到一种分子量均一的ISP 2多糖。洪阁等[15]用Sephadex G-200分离纯化得到了银耳碱多糖的均一组分TFBP-A 。高义霞等[16]将经脱蛋白、脱色后的沙蒿多糖用 ultrahydrogel TM 500层析分离纯化,0.1 mol/L磷酸缓冲液洗脱,在凝胶色谱中出现单一而对称的峰,纯化效果好、纯度高。凝胶柱层析是目前植物多糖最常用的高级纯化方法。

1.3.2阴离子交换柱层析法 阴离子交换柱层析适合于分离各种酸性、中性多糖和黏多糖。常用的交换介质有DEAE-纤维素、DEAE-葡萄糖凝胶、DEAE-琼脂糖凝胶,最常用的阴离子交换柱层析填料是DEAE-纤维素,既可纯化多糖,还可分离各种多糖。洗脱剂可用不同浓度的碱溶液、硼砂溶液和盐溶液等。在pH值为6时，酸性多糖能吸附于交换剂上,中性多糖不吸附。然后用pH值相同，但离子强度不同的缓冲液将酸性强弱不同的酸性多糖分别洗脱下来。但如果柱为碱性,则中性多糖也能吸附,吸附力一般随多糖分子中酸性基团的增加而增加。罗娅君等[17]采用DEAE-纤维素柱层析从大叶金花草粗多糖中分离出中性多糖和酸性多糖。该方法主要用于多糖的初级纯化。吴彦[18]将实验得到的大蓟粗多糖用DEAE-纤维素离子交换柱层析进一步分离纯化,通过蒸馏水和NaCl溶液梯度洗脱,再通过透析、浓缩和冷冻干燥得到DJ1,DJ2,DJ3,DJ4和DJ5 5个次级组分。其中以0.4 mol/L NaCl溶液洗脱出的DJ2组分得率最高,为0.806%。

1.3.3大孔树脂柱层析法 大孔树脂分离技术应用于多糖,已有多个文献对其进行了描述,主要用于提取液中多糖的纯化以及脱色。如朱建飞等[19]用特1号大孔吸附树脂对菜籽多糖水溶液脱进行脱蛋白和脱色,其效果良好。陈木森等[20]研究了8种树脂对青钱柳多糖的静态吸附性能,筛选出一种吸附较好的树脂,并利用柱层析进行青钱柳多糖的纯化研究。结果表明,D301R树脂对青钱柳多糖吸附量最大,效果较好。但方积年等[9]认为,大孔树脂吸附适合分离小分子物质,分离纯化多糖易使多糖活性降低,故不宜使用。

1.3.4其他分离纯化方法 除常用方法外,还有一些方法用于多糖的分离纯化。如制备性区域电泳法,利用不同质荷比多糖在电场作用下迁移速度不同而达到分离；盐析法,根据不同多糖在不同盐浓度中溶解度不同而达到分离；金属络合物法,利用多糖能与某些金属离子(铜、钡、钙、铅等)形成络合物沉淀而分离；过氧化氢法与反胶束法也可以对多糖脱色使其得到纯化。此外,结晶法、酶解法、透析袋法、超速离心法、亲和色谱分级法、制备性高压液相色谱、活性碳柱色谱法、离心沉淀色谱法、微波辅助及逆流色谱法(CCC)等方法[21-23]也有应用,但由于适应对象较少或技术要求较高而较少使用。

多糖的分离纯化，如仅用一种方法难以获得组分较单纯的植物多糖,只有将两种或多种纯化方法有机地结合起来,充分利用每种纯化方法的优势,才能使多糖组分高效的分离。

2 现状与展望

多糖的药理作用广泛,以独特的活性和低毒性的特点使其在临床应用中具有很大的潜力。我国丰富的动植物资源为中药多糖的开发提供了得天独厚的条件,原料成本低廉、资源丰裕,为多糖提取的产业化应用提供了较大的发展空间。

然而,多糖的研究与蛋白质和核酸的研究相比,还有相当的差距，这与多糖本身结构比较复杂、种类繁多、其分离纯化难度大、有些多糖含量低等诸多因素有关,给多糖的研究和应用带来许多的挑战,这还需要广大科学工作者的继续努力。多糖的分离纯化方法在不断更新,但在选取方法时,应当关注目标多糖的性质和特点,综合比较后进行实验,才能选取最佳的方法和工艺。

因此,开展中药多糖分离纯化方法的研究,既可以为扩大该类药物药源提供了科学的依据,又可以进一步促进多糖类药物的发展,为开发出低毒、高活性的多糖类新药提供理论依据。

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