药物对细胞自噬性死亡的干预作用*

邢国胜，贺桂泉，赵文君

(1.天津市天津医院，天津 300211； 2.天津市体北医院，天津 300060)

细胞自噬性死亡(autophagic cell death)源于希腊语，意为自体吞噬(self-eating)，简称自噬(autophagy)，是区别于细胞凋亡(apoptosis)的另一种细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)形式[1]。近年来，随着分子生物学和基因组学等实验方法的快速发展和日臻完善，尤其是酵母自噬突变株的产生，使细胞自噬性死亡的分子基础研究有了很大的进展，尽管药物与细胞自噬性死亡关系的研究尚处于探索阶段，但已逐步成为一个新的研究热点，受到各领域学者的广泛关注。通过研究药理作用不同的各类药物对细胞自噬性死亡的影响，可能会对许多疾病，包括心肌缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)损伤、神经退行性疾病、肿瘤、感染等的发病机制和防治策略提出新的观点。本文对近年药物干预不同类型细胞自噬性死亡的研究进展进行概述。

1 细胞自噬性死亡的分类及检测方法

细胞自噬性死亡首见于1962年，通过电子显微镜观察到其起始于细胞质内半环状双层或多层膜结构的自噬泡的形成，进而包绕大量细胞质和线粒体、内质网等细胞器，形成自噬体(autophagosome)，然后与溶酶体融合，成为自噬溶酶体(autolysosome)，最终通过溶酶体内的蛋白酶降解其内成分，所有这些过程均在同一细胞中完成[2]。目前细胞自噬性死亡一般分为三类：巨自噬或称大自噬(macroautophagy)、微自噬或称小自噬(microautophagy)及分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)[3]。巨自噬即通常所指的自噬主要负责降解细胞内稳定并永久存在的蛋白质，产生氨基酸以维持细胞在缺乏营养时的生存。微自噬包绕底物的是自身发生内陷的溶酶体膜，并断裂成小液泡以便在内腔中消化。CMA的底物都是可溶的蛋白质分子，在清除蛋白质时有选择性，而前两者无明显的选择性[4]。

细胞自噬性死亡的检测方法目前大致分为形态学方法、免疫染色方法及分子生物学技术。如同研究细胞凋亡时观察凋亡小体的存在，用形态学方法研究细胞自噬性死亡最直接的证据就是利用电子显微镜观察双层膜的自噬体及其内容物，在透射电镜下可见到线粒体的肿胀变性，其周围出现空泡状双层膜样结构，然后双层膜环绕成自噬体，进而与溶酶体融合，消化，也可见自噬溶酶体内最终不能降解的残体等，该方法目前被认为是检测自噬体的金标准。通过计算自噬体的面积或体积占整个细胞的总面积或总体积的比例，还可以对自噬性细胞死亡进行定量检测，但受实验方法的局限性，往往达不到很精确的程度[5]。免疫染色方法可直接观察到参与自噬体膜形成的哺乳动物自噬标记蛋白Beclin 1和微管相关蛋白1的轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAP1-LC3)蛋白的表达，利用流式细胞仪或荧光显微镜等仪器还可对相关标志物进行定量或半定量测定。其中，自噬体膜标志性蛋白质的检测是通过对自噬体膜上存在的Apg12/Apg5结合体和LC3等标志性蛋白质的检测来定量检测自噬，而胞质型(I型)和膜型(II型)LC3的比例及LC3-II的含量则代表着自噬体的程度与数量[6]。另外，还可利用LC3与磷脂酰乙醇胺即脑磷脂(phosphatidyl ethanolamine,cephalin,PE)结合的形式(LC3-PE)存在于自噬体形成各阶段的内、外膜及自噬溶酶体膜上的特点来间接定量检测自噬，即通过与绿色荧光蛋白 ( green fluorescent protein,GFP)结合成Apg12-Apg5-GFP和LC3-GFP来实现对自噬体的检测[7]。单丹(磺)酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)染色法则是一种可在分子水平分析自噬发生机制的特异性检测方法，自噬体形成所依赖的第二个泛素样结合系统(Apg8)是位于自噬囊泡膜上与MDC特异结合的生化标志，通过荧光染色，MDC可被细胞吸收并选择性地聚集于自噬囊泡，在荧光显微镜下可见核周区域阳性显色，呈点状结构，故可利用这种方法对自噬进行定量检测[8]。自噬溶酶体及其不能降解产物(残体)的检测也是一种间接自噬体检测法，自噬体和溶酶体融合后，可利用吖啶橙作为非极性反胶态分子团的分子探针，当自噬溶酶体内酸性磷酸酶活性增强时会显著着色，对残体的检测则主要是对脂褐素颗粒的显微观察。近年来，许多学者还利用GFP-LC3转基因动物研究自噬，也有学者利用细胞培养转染技术和Beclin 1基因敲除等分子生物学方法进行研究[9]。

2 药物对细胞自噬性死亡的影响

2.1内皮抑素(endostatin) 肿瘤内的血管是新生的，肿瘤可通过这些新生的血管实现肿瘤间质的血管化，并在肿瘤的生长和扩散中起重要的作用。近年来，抑制肿瘤新生血管生成已成为抗肿瘤药的新靶点。肿瘤内出现血管后，除了血管带给瘤细胞营养外，内皮细胞本身对瘤细胞也有旁分泌刺激作用。肿瘤新生血管的旁分泌效应源于内皮细胞产生的生长因子和细胞因子，其可刺激肿瘤细胞生长和转移。内皮抑素为内源性血管细胞增殖的强效生成抑制剂，既往研究显示其可通过特异性抑制内皮细胞增殖和迁移、黏附过程，阻止血管生成而发挥抗肿瘤作用。近年研究证实，用内皮抑素诱导人内皮细胞株EAhy 926的死亡主要是自噬性的死亡。电镜下观察内皮抑素作用于人内皮细胞6，24 h后就可见大量的自噬泡。内皮抑素产生的细胞毒作用不依赖于caspase途径和氧化途径，但可被3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)和亮肽素，抑酞酶(丝氨酸，半胱氨酸溶酶体蛋白抑制剂)所调控[10]。

2.2环孢素A(cyclosporine A，CsA) 环孢素A是目前临床上最常用的化疗药物之一，其不仅是化疗药物的增敏剂，而且可以直接抑制多种肿瘤细胞的生长，导致非典型的细胞凋亡[11]。随着自噬研究的广泛开展，有研究表明，环孢素A可以增强胶质瘤细胞的自噬性死亡，通过Western印迹法检测发现，2 μmol/L浓度的环孢素A可以上调三氧化二砷诱导的的胶质瘤细胞U87-MG 表达Beclin-1，明显高于环孢素A和三氧化二砷单独对照组，LC3-II蛋白也明显增加(P<0.05)。可见，小剂量环孢素A可增加三氧化二砷诱导的细胞自噬性死亡，使其C50由单独作用时的4.28 μmol/L降低至1.28 μmol/L[12]。

2.3丙戊酸(valproic acid，VPA) 丙戊酸是经典的广谱抗癫痫药物，为组蛋白去乙酰化酶抑制药(histone deacetylase inhibitors,HDACIs)，具有一定的肿瘤生长抑制作用，可以通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)、p21WAF1等多种信号转导途径和基因诱导使U937、Jurkat clone E6-1(Jurkat)和BALL-1等肿瘤细胞发生凋亡，其可能成为一种有潜力的抗肿瘤治疗新药物[13-15]。深入研究发现，丙戊酸在诱导细胞凋亡的基础上，对多种肿瘤细胞的自噬也具有不同程度的诱导作用。经0.25、0.50、1.00、2.00、5.00和10.0 mmol/L丙戊酸处理的人脑胶质瘤细胞系U87、T98G和SF295的细胞用透射电子显微镜、荧光测定仪和Westem blotting方法观察超微结构、自噬水平及细胞内LC3-II、Beclin-1、p-Akt和p-p70S6K等蛋白质的表达水平，通过透射电子显微镜可见经2.50 mmol/L丙戊酸处理96 h后，人脑胶质瘤细胞系U87细胞胞质内有大量自噬体和自噬溶酶体，0.50、1.00、2.00和5.00 mmol/L丙戊酸处理后，MDC荧光强度均明显强于对照组(P<0.05)，其自噬水平随丙戊酸浓度的升高而逐渐增强；经丙戊酸处理后，人脑胶质瘤细胞系U87细胞自噬相关蛋白LC3-II和Beclin-l表达水平明显升高，而p-Akt和p-p70S6K表达水平明显降低。因此，丙戊酸可诱导胶质瘤细胞发生自噬，其诱导胶质瘤细胞发生自噬的机制可能与阻断Akt信号转导通路有关[16]。

2.4碳酸锂(lithium carbonate) 碳酸锂临床常用于癫狂症的治疗，具有情绪控制的作用，对躁狂和抑郁交替发作的双相情感性精神障碍有很好的治疗和预防复发的作用，对反复发作的抑郁症也有预防发作作用，可用于治疗分裂-情感性精神病。近年研究发现，碳酸锂具有降低突变蛋白的聚集和细胞死亡率的作用，并可诱发哺乳动物的细胞自噬。对于神经细胞株PC12，强力霉素能够稳定地诱导huntingtin polyQ突变体(HDQ74)的产生，用碳酸锂处理后可有效地清除可溶性HDQ74，并减少HDQ74和α-synucleins的聚集，这种作用可被3-MA所抑制；在清除HDQ74和α-synucleins过程中，细胞自噬的特征蛋白质II型LC-3的含量明显增加，通过荧光检测发现LC-3成囊泡状分布。可见，碳酸锂可通过细胞自噬清除HDQ74和α-synucleins。另外，碳酸锂通过抑制肌醇-磷酸酶(inositolmonophosphatase，IMPase)活性引起肌醇(myoinositol)和三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)的减少，诱发细胞自噬性死亡，而加入肌醇和脯氨酰内肽酶抑制剂(proyl endopeptidase inhibitor，PEI)后，IP3的含量提高，其引起细胞自噬的作用也被同时减弱，进一步说明碳酸锂盐诱发细胞自噬性死亡的作用主要由IP3的含量来调控。碳酸锂通过抑制IMPase来诱发细胞自噬性死亡的作用并不依赖于对mTOR的抑制，提示这可能是一个新的作用途径[17]。

氨茶碱(aminophylline) 氨茶碱用于治疗支气管哮喘已有50多年的历史，近年来发现氨茶碱除了具有支气管舒张作用外，还具有抗炎和免疫调节等作用，而后者很可能是氨茶碱治疗哮喘的重要的机制。T淋巴细胞是肌体免疫调控的主要组成成分，其死亡方式对人体免疫状态有重要影响。分别予小鼠1、5、25和125 mg/kg氨茶碱10 d后，观察通过流式细胞仪检测分离出的脾T淋巴细胞的自噬及凋亡变化，发现各浓度氨茶碱组T淋巴细胞自噬率与阴性对照组比较均明显下降(P<0.05)。氨茶碱体内干预后，可诱导小鼠脾T淋巴细胞自噬率下降，凋亡率增加，提示此药可能通过T淋巴细胞的不同程序性死亡方式来调节肌体免疫功能[18]。值得注意的是，氨茶碱在体外却增加外周血T淋巴细胞的自噬率。同样使用流式细胞仪检测经氨茶碱、地塞米松干预培养的健康人外周血T淋巴细胞的自噬和凋亡现象，发现10-5～10-3mol/L的氨茶碱干预T淋巴细胞培养72 h后，体外培养的T淋巴细胞自噬率变化呈剂量依赖性，自噬率与阴性对照组比较均有显著性差异(P<0.05)，各浓度组的自噬率和凋亡率之间均无相关性(P>0.05)；按不同细胞密度接种T淋巴细胞，10-5mol/L氨茶碱干预0、24、48和72 h后发现，随着细胞密度的减少和时间的延长，其自噬率有增加趋势，但无显著性差异。此结果说明10-5～10-3mol/L氨茶碱可诱导人外周血T淋巴细胞自噬率增加，而自噬与凋亡间可能相互独立[19]。氨茶碱对细胞自噬性死亡干预的体内和体外不一致性的相关机理研究尚未见文献报道。

2.6曲格列酮(troglitazone,Trog) 曲格列酮是过氧化酶体增殖激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR gamma,PPAR)的配体之一，是该类配体中第一个用于临床治疗II型糖尿病的药物，由于其肝脏毒性大，仅上市3年就被美国FDA撤出了临床。尽管如此，曲格列酮在某些领域仍具有一定的研究价值，相关的实验研究从未中断。利用电镜对经25 mol/L Trog处理后的HeLa细胞(人宫颈癌上皮细胞株)进行观察发现，Trog能够诱导HeLa细胞自噬活动的增加，刺激8 h后细胞内的自噬体明显增加；HeLa细胞转染GFP-LC3后，用Trog刺激4 h，荧光显微镜下观察GFP-LC3的点状显色数显示相对于对照细胞，Trog明显增加细胞自噬体的数量(P<0.01)；免疫杂交结果则显示该药能增加自噬相关基因LC3的表达，并于刺激后4 h达到高峰[20]。这为同类药物的进一步开发及临床应用提供了极有价值的结果。

2.7阿托伐他汀(atorvastatin) 他汀类药是广泛应用于临床的一种调脂药，除调脂作用外，还有很多有益的心血管保护作用，被称为他汀类药的多效性，其中最突出的作用是改善血管内皮功能，但其改善内皮功能的机制尚未完全阐明。近年，有学者通过不同时相使用阿托伐他汀对血管内皮细胞自噬的影响，从细胞学方面探讨其可能机制。用Hank’s液替代培养基进行饥饿诱导血管内皮细胞发生自噬的模型，在诱导自噬前和诱导过程中使细胞分别与含或不含阿托伐他汀的正常培养基或Hank’s液共孵育，用透射电镜检测空白对照组、诱导前和诱导中都应用阿托伐他汀组,以及仅在诱导中应用阿托伐他汀组和仅在诱导前应用阿托伐他汀组细胞发生自噬的情况。结果各组细胞均出现典型的自噬细胞形态学改变，与对照组相比，诱导前和诱导中都应用阿托伐他汀组和仅在诱导中应用阿托伐他汀组的自噬泡占胞质总面积的比值均明显降低(P<0.01)；诱导前应用阿托伐他汀组的该比值低于对照组；诱导前和诱导中都应用阿托伐他汀组的该比值低于仅在诱导中应用阿托伐他汀组。可见，阿托伐他汀可抑制血管内皮细胞的自体吞噬，这一作用可能与阿托伐他汀改善血管内皮功能的机制有关[21]。

2.8维生素D类似物EB1089 多年来，维生素D的抗肿瘤作用备受关注，但严重的高钙血症副作用影响了其在临床中的应用。于是，国内、外学者合成并研究了一些维生素D类似物，其中，EB1089为代表药物，其既有很强的抗肿瘤活性，又能明显减轻高钙血症的发生。EB1089对体外培养的所有类型的肿瘤细胞几乎均有抑制或促分化作用，其抗肿瘤作用机制主要是诱导抗肿瘤细胞周期阻滞、促进肿瘤细胞分化及诱导肿瘤细胞凋亡。用EB1089处理人乳腺癌细胞时，可引起细胞G1期阻滞，S期细胞数目下降，从而使G0/G1期细胞堆积；还可诱导处于G1/G2期的白血病细胞向成熟阶段分化，阻遏细胞进入S期；另外，EB1089还能抑制乳腺癌细胞和结肠癌细胞的生长[22]。近年国外学者通过对EB1089的深入研究发现，其诱导的多种细胞死亡均与细胞自噬相关，MCF-7细胞死亡时虽不依赖于caspase，但也能引起染色质凝聚和DNA断裂。荧光显微镜下观察MDC染色发现，约40%经EB1089处理的MCF-7细胞呈强阳性。而EB1089干预共转染了红色荧光蛋白DsRed1和LC3-β与组蛋白2β-GFP融合蛋白的MCF-7细胞后，红染细胞增加了约20%；干预1～4 d后，LC3-β阳性细胞开始增加；其诱导的细胞死亡可被3-MA所抑制。EB1089的这种启动核凋亡的作用中包括了依赖Beclin 1的自噬途径[23]。

3 结语与展望

自噬性死亡对细胞的存活与死亡都有作用，是把双刃剑，但其具体机制还有待研究。药物干预细胞发生自噬性死亡与药物的种类、细胞的类型、药物的浓度和药物作用细胞的时间等多种因素有关。由于自噬的特点，药物诱导细胞产生自噬性细胞死亡后会出现两种不同的结果：一种是保护细胞防止周围环境带来的损害；另一种是启动细胞主动性的Ⅱ型细胞死亡程序。目前，对于这两种不同结果的产生还没有发现特定的规律。找到靶向作用于自噬性细胞死亡分子机制的药物对于多种疾病的分子治疗具有重要的意义。通过药物诱导某些对肌体有害的细胞如肿瘤细胞产生自噬，继而引起细胞死亡，对治疗某些严重影响人类生存的疾病将会起到积极作用。另外，通过研究药物对自噬性死亡相关基因表达的调控，对于寻找治疗肿瘤、病原体感染与免疫、神经变性疾病和线粒体性肌病等疾病的有效措施具有重要意义，并为药物基因组学的发展奠定基础。

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