大剂量放疗后豚鼠内耳螺旋神经节细胞Caspase 3的表达*

谢利红 唐安洲 尹时华 谭颂华

放射治疗是头颈部恶性肿瘤的主要治疗手段。在放射治疗中，患者的内耳、听神经和部分脑干均包括在照射野内[1]。60Co辐射导致感音神经性耳聋为其常见的并发症，严重影响患者的生存质量。Caspase 3是近年来发现的类半胱氨酸蛋白酶家族成员之一，是细胞凋亡中的关键蛋白酶，单独或协同参与水解与凋亡有关的蛋白质[2]。本文旨在研究Caspase 3在螺旋神经节细胞（SGC）中的表达，对放疗后螺旋神经节细胞（SGC）的损伤情况进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物 白化豚鼠40只，体质量250～350 g，普通级，购自湖南省长沙市开福区东创实验动物科技服务部，雌雄不拘。豚鼠自由饮水进食，室温23～26℃。全部实验动物用电耳镜检查无中耳感染，耳廓反应灵敏。随机分为5组，每组8只，右耳为放射组，左耳为对照组。

1.2 方法

1.2.1 照射方法 豚鼠用1%戊巴比妥钠（3.5 μL/g）麻醉固定后，用GWXJ80型60Co远距离治疗机对豚鼠右耳颞部做一次性60Co照射70 Gy，辐射深度2.0 cm，照射范围为2 cm×2 cm，源皮距80 cm，自制铅板遮盖非照射部位。

1.2.2 石蜡标本制备 实验动物于放疗后1、4、7、14和30 d用1%戊巴比妥钠（3.5 μL/g）麻醉后处死，经腹侧取听泡，暴露耳蜗并在蜗尖钻孔，推镫骨底板脱位，刺破圆窗膜，用4%多聚甲醛固定液灌流固定后，再放入固定液4℃固定24 h以上。用10%EDTA脱钙10～14 d，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，耳蜗中轴切片。

1.2.3 HE染色 石蜡切片脱蜡和水化，苏木精染液染色10 min，1%盐酸乙醇分色，流水冲洗后，自来水蓝化10 min，0.5%伊红染液染色1 min，依次经70%、85%、95%和100%乙醇脱水，二甲苯透明，封片。

1.2.4 免疫组织化学 石蜡切片脱蜡和水化，pH 6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液煮沸热修复抗原10 min，3%H2O2室温孵育15 min，非免疫血清封闭10 min，加Caspase 3一抗（1∶500）4℃6 h，加二抗，室温下孵育10～15 min，加三抗室温下孵育10～15 min，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。阴性对照染色切片用PBS代替一抗，其他实验步骤不变。Cas⁃pase 3的阳性表达为细胞浆呈棕黄色染色。通过IPP6图像分析软件计算其光密度（OD）值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SGC的HE染色 对照组豚鼠SGC结构正常，见图1，而放疗组的SGC在放疗后不同时间点出现SGC的萎缩，表现为细胞浆的减少、细胞核浓缩凝集、缺失或者整个细胞的缺失，见图2。放疗后各不同时间点SGC萎缩率与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），并且随着放疗后时间的延长，上述变化更明显，见表1。

2.2 SGC的免疫组化染色 放疗组SGC的Caspase 3阳性表达较对照组增强，见图3～5。放疗后不同时间点SGC的Caspase 3 OD值与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 SGC萎缩细胞率及Caspase 3的OD值（n=8，±s）

表1 SGC萎缩细胞率及Caspase 3的OD值（n=8，±s）

t为放疗各组与对照组比较；＊＊P＜0.01

组别对照组放疗组1 d 4 d 7 d 14 d 30 d F SGC萎缩（%）0 22.68±2.45 26.32±1.28 27.26±1.02 32.76±1.25 49.20±6.07 155.54＊＊t-t-12.78＊＊14.84＊＊15.36＊＊18.46＊＊27.73＊＊Caspase 3（OD值）16.38±3.39 45.83±7.20 44.89±5.22 143.68±9.07 28.55±1.29 42.35±5.07 249.13＊＊7.21＊＊6.98＊＊31.17＊＊2.98＊＊6.36＊＊

3 讨论

有学者通过观察放疗后内耳螺旋器（Corti器）和血管纹的损伤发现，放疗后内耳细胞的损伤呈剂量相关性[3]。放疗对Corti器，外毛细胞损伤比内毛细胞更严重。也有学者发现，一次性使用50 Gy剂量对豚鼠耳蜗进行辐射，明显地产生了听觉障碍，光镜及电镜观察中均发现辐射对于耳蜗基底膜内毛细胞的破坏要比外毛细胞更为严重，并出现神经末梢及突触的损害，并认为这种听功能的损害不仅与内毛细胞的损害有关，还与神经及突触的破坏有关[4]。

Enver等[5]研究发现给予耳颞部33 Gy的放疗总剂量后数小时即可出现耳蜗细胞的损伤，表现为螺旋神经节细胞萎缩或消失，毛细胞缺失，血管纹的萎缩等表现。本研究中也发现一次性给予70 Gy的射线照射后，出现明显的耳蜗螺旋神经节细胞的损害表现。动物实验证明，在非放疗（如噪声、药物等）引起的耳蜗细胞损伤中，活性氧起到重要作用，活性氧通过影响线粒体的渗透压，促进细胞色素C的释放，活化P53和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，促进细胞凋亡[6]。Caspase 3正常情况下，以无催化活性的酶原形式存在于胞质内。当细胞进入凋亡过程时，则经由特异的Asp残基处的蛋白水解作用而被激活，从而产生了蛋白水解作用，形成的Caspase自我放大级联反应，进而裂解DNA损伤细胞。Cas⁃pase 3阳性表达意味着细胞凋亡在进行过程中。在本研究中，放疗后1、4、7、14和30 d均可见SGC的细胞浆内有Caspase 3蛋白表达，表明Caspase 3的活性增高可能与放疗后内耳螺旋神经节细胞的损伤有关，可能参与了放射治疗诱导耳蜗细胞凋亡损伤的调控。

[1]Ondrey FG,Greig JR,Herscher L.Radiation dose to otologic struc⁃tures during head and neck cancer radiation therapy[J].Laryngo⁃scope,2000,110(2):217-221.

[2]Labbe D,Teranishi MA,Hess A,et al.Activation of caspase-3 is asso⁃ciated with oxidative stress in the hydropic guinea pig cochlea[J]. Hear Res,2005,202(1-2):21-27.

[3]Kim CS,Shin SO.Ultrastructural changes in the cochlea of the guin⁃ea pig after fast neutron irradiation[J].Otolaryngol Head Neck Surg, 1994,110(4):419-427.

[4]王家东，丁大连，金西铭，等.一次性大剂量60钴辐射对豚鼠耳蜗影响的实验研究[J].听力学及言语疾病杂志,1999,7(3):141-142.

[5]Enver A,Mustafa V,Ozan K,et al.Effects of piracetam supplementa⁃tion on cochlear damage occuring in guinea pigs exposed to irradia⁃tion[J].Biol Pharm Bull,2006,29(7):1460-1465.

[6]Low WK,Tan MG,Sun L,et al.Dose-dependant radiation-induced apop⁃tosis in a cochlear cell-line[J].Apoptosis,2006,11(12):2127-2136.