氯通道在鼻咽癌细胞凋亡性细胞容积减小和细胞凋亡中的作用*

潘廷才 杨林杰 刘善文 李华荣 朱林燕 叶文才 王立伟 陈丽新

细胞凋亡早期的细胞容积减小称为凋亡性细胞容积减小（apoptotic volume decrease，AVD）。AVD是具有普遍性意义的细胞凋亡早期的标志性事件，是细胞凋亡的一个重要特征。目前关于AVD的发生机制尚不清楚，有报道称氯通道在AVD的发生过程中发挥着至关重要的作用[1]。笔者前期研究表明，抗肿瘤药物可通过激活氯通道引起AVD，继而诱导细胞发生凋亡而发挥其抗癌作用[2]。5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-Fu）是临床上常见的抗癌药，诱导细胞凋亡是其抗肿瘤的机制之一[3]。氯通道在5-Fu诱导细胞凋亡中是否发挥作用目前尚不清楚。本研究旨在研究氯通道在5-Fu诱导的细胞凋亡中的作用，从离子通道和AVD的角度探讨5-Fu在细胞凋亡中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 溶液及试剂 等渗灌流液（ISO）含70 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L MgCl2，2 mmol/L CaCl2，10 mmol/L HEPES和140 mmol/L D-甘露醇。用D-mannitol调节至300 mmol/L。配好的液体用冰点计（Osmomat030，Gono2tec）检测溶液渗透压，用Tris液调pH值至7.4。5-Fu购自上海旭东海普药业有限公司，氯通道阻断剂5-硝基-2-（3-苯丙胺）苯甲酸（NPPB）购自Sigma公司。用二甲基亚砜（DMSO）配制成100 μmol/L的储存液，使用前用灌流液稀释至100 mmol/L。

1.2 细胞培养 低分化鼻咽癌细胞CNE-2Z用含10%小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640生长液培养在37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱内，按常规方法传代。实验前用0.25%胰酶和0.02%EDTA进行消化传代，收集并重悬细胞，细胞悬液接种在直径22 mm的圆形玻片上，放入培养箱使细胞贴壁，待细胞贴壁1 h后进行实验。

1.3 细胞容积测量 分别用100 μmol/L 5-Fu（5-Fu组）、100 μmol/L 5-Fu+100 μmol/L NPPB（5-Fu+NPPB组）处理细胞，另外设未加任何处理因素的为对照组。采用笔者前期文献报道的方法测定细胞的容积[4]。将细胞贴壁生长的玻片安放在特制的0.3 mL浴槽中，灌流速度2 mL/min。在倒置相差显微镜（IMT-2，Olympus，Japan）下，选择并固定拍摄视野，用CCD数字式摄像机（Cohu，Inc.USA）每隔2 min拍摄细胞图像1幅，用Scion Image图像分析软件（Scion Co.，USA）控制拍摄并进行细胞图像分析，分别选取药物作用后6、30、60、90和120 min5个时间点进行细胞容积计算并经标准化处理。标准化细胞容积（Vst）=（Vt/Vo）×100，其中Vt是实时测得的细胞容积，Vo是同一细胞在等渗条件下的平均容积。所有实验在室温20℃～27℃进行。

1.4 核DNA染料Hochest 33258荧光染色技术检测细胞凋亡 选用对数生长期的CNE-2Z细胞，接种于24孔板内，培养过夜，使细胞长至50%～80%满，5-Fu及5-Fu+NPPB处理后，吸去培养液，每孔加入0.5 mL固定液，室温固定10 min，吸去固定液，每孔加入0.5 g/mL Hoechst 33258染色液0.3 mL，在室温下避光静置，染色15 min后吸尽染液，PBS液洗2次，然后在倒置荧光显微镜下计数，每次每个实验组计数300个细胞，辨认凋亡细胞和活细胞，细胞核或细胞质内见浓染致密的颗粒状亮蓝色荧光者为凋亡细胞，呈弥散均匀的淡蓝色荧光者为活细胞，计算凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数× 100%，抑制率=（5-Fu组凋亡细胞数-5-Fu+NPPB组凋亡细胞数）/5-Fu组凋亡细胞数×100%。每组设3个复孔，并重复3次取平均值。

1.5 统计学处理 所有数据经SPSS 13.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差（±s）表示，3组比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组CNE-2Z细胞Vst比较 细胞处于等渗液中（处理前），细胞容积及细胞形态保持稳定不变。5-Fu处理120 min后，细胞皱缩，体积变小，部分细胞由圆形变成不规则状，见图1A、B。细胞受到5-Fu刺激后，Vst均小于对照组，差别有统计学意义（P＜0.01）。细胞接受5-Fu+NPPB处理后120 min，细胞体积变化不明显，见图1C、D。在5个不同时间点，5-Fu+NPPB组对细胞Vst的影响均小于5-Fu组，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表1。

图1 NPPB和5-Fu对CNE-2Z细胞Vst的影响（×640）

表1 不同时间3组CNE-2Z细胞Vst比较（n=16，%，±s）

表1 不同时间3组CNE-2Z细胞Vst比较（n=16，%，±s）

＊＊P＜0.01

组别对照组（1）5-Fu组（2）5-Fu+NPPB组（3）F P（1）∶（2）（2）∶（3）6 min 100.3±0.2 99.5±0.1 100.1±0.2 9.680＊＊0.007 0.001 30 min 100.2±0.3 96.2±0.4 100.4±0.2 32.369＊＊＜0.001＜0.001 60 min 99.6±0.2 91.9±0.4 99.4±0.3 61.313＊＊＜0.001＜0.001 90 min 99.1±0.3 88.8±0.4 98.1±0.4 53.116＊＊＜0.001＜0.001 120 min 99.3±0.4 88.2±0.4 98.5±0.6 111.400＊＊＜0.001＜0.001

2.2 3组CNE-2Z细胞凋亡情况分析 经Hochest荧光染色后，对照组细胞染色质分布均匀，为弥漫均匀的淡蓝色低强度荧光，见图2A。细胞凋亡率（1.8±0.5）%。经5-Fu处理细胞48 h后，呈现出典型的凋亡特征，大量的细胞核呈浓缩致密的固缩形态或颗粒状荧光，有明显的凋亡小体出现，部分核染色体碎片状，凋亡细胞明显增加，凋亡率（49.2± 2.6）%，见图2B。而经5-Fu+NPPB处理后，细胞核呈浓缩致密的固缩形态或颗粒状荧光的凋亡细胞明显减少。细胞凋亡率（12.5±2.9）%，抑制率（74.9±3.5）%，见图2C。

图2 3组CNE-2Z细胞Hochest荧光染色图（Hoechst 33258染色×280）

3 讨论

本研究结果表明，抗癌药5-Fu在数分钟内就可使细胞容积缩小，并随时间的延长该作用更明显，提示早期细胞皱缩可能是5-Fu抗肿瘤作用的关键步骤或标志现象之一。早期AVD已在凋亡诱导剂十字孢碱、肿瘤坏死因子（TNF）-α或Fas配体等诱导的多种细胞凋亡中观察到，被认为是凋亡过程中具有普遍性意义的标志性事件[5]。本研究显示，氯通道阻断剂NPPB可抑制5-Fu诱导的细胞皱缩，提示氯通道的激活是5-Fu诱导细胞产生AVD的关键因素。传统观点认为氯通道被5-Fu激活的机制是通过非DNA作用途径激活氯通道，进而诱导AVD的发生。5-Fu主要通过影响DNA的合成或损伤DNA而引起细胞凋亡耗时较长，而5-Fu引起的AVD在几分钟内就可观察到。有关氯通道在AVD中的作用，也可在一些其他凋亡诱导剂引起的AVD中观察到[6]。笔者前期研究显示氯通道参与凋亡诱导剂顺铂和过氧化氢诱导的AVD[5]。

本实验表明，5-Fu可诱导鼻咽癌细胞凋亡，而5-Fu的这一作用可被氯通道阻断剂NPPB所抑制，提示氯通道的激活是5-Fu诱导细胞凋亡的重要环节之一，5-Fu可能通过某种未知的机制激活氯通道，进而激活或启动细胞凋亡机制，最终引起细胞凋亡。氯通道与细胞凋亡的关系也在凋亡诱导剂顺铂[2]和过氧化氢[5]诱导细胞凋亡的过程中观察到。至于在诱导细胞凋亡过程中，氯通道以及与氯通道有关的AVD通过何种机制来参与调节不同机制引起的细胞凋亡，有待进一步研究。

综上，氯通道的激活与5-Fu诱导的鼻咽癌AVD及凋亡密切相关，氯通道可能是5-Fu抗肿瘤的关键靶点之一。

[1]Krumschnabel G,Maehr T,Nawaz M,et al.Staurosporine-induced cell death in salmonid cells:the role of apoptotic volume decrease, ion fluxes and MAP kinase signaling[J].Apoptosis,2007,12(10): 1755-1768.

[2]阳小雅,王立伟,陈丽新,等.顺铂激活的低分化鼻咽癌细胞氯电流[J].中国病理生理杂志,2009,25(4):666-669.

[3]Sasaki K,Tsuno NH,Sunami E,et al.Chloroquine potentiates the anti-cancer effect of 5-fluorouracil on colon cancer cells[J].BMC Cancer,2010,15(10):370.

[4]Wang LW,Chen LX,Zhu LY,et al.Regulatory volume decrease is actively modulated during the cell cycle[J].Cell Physiol,2002,193（1）:110-119.

[5]Zuo W,Zhu L,Bai Z,et al.Chloride channels involve in hydrogen peroxide-induced apoptosis of PC12 cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,387(4):666-670.

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