甲状腺素对甲状腺功能减低大鼠子代脑组织中同源盒基因Nkx2.2表达的影响*

赵金超 张 瑞 汪蓓蕾 郭 刚

甲状腺素是哺乳动物生长发育最重要的激素之一。同源盒基因是在进化上高度保守的DNA序列。同源盒基因Nkx家族中的许多成员在脑组织中的不同区域表达，提示其可能参与了不同脑区的发育过程[1]。研究发现补充甲状腺素与脑组织Nkx2.1[2]及Nkx6.1[3]的基因表达水平存在相关性。关于Nkx2.2的研究目前多集中在其对胰腺功能的影响[4]，以及对于少突胶质细胞、内脏运动神经元分化的影响[5]等方面。而关于其与甲状腺素方面的研究较少。本研究通过对妊娠早、晚期甲状腺功能减低（甲低）孕鼠补充不同剂量的甲状腺素，探讨甲状腺素对子代大鼠脑组织中同源盒基因Nkx2.2表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物模型制作与分组 选用断乳1个月的雌、雄性SPF/ VAF级Wistar大鼠（购自军事医学科学院实验动物中心）各120只，体质量100～120 g。适应性饲养1周后，将雌性大鼠随机分为2组：对照组（15只），甲低组（105只），甲低组鼠均饲以重度缺碘地区粮食配制的饲料，成分为玉米∶黄豆∶小麦∶小米＝3∶3∶3∶1，另外添加必需氨基酸、维生素和无机盐等，饲料经过食品中碱的灰化-砷铈催化分光光度法测定，含碘量为13.66 ng/g。甲低组均饮去离子水；对照组饮含碘量为200 μg/L碘酸钾溶液，总碘摄入量相当于大鼠生理碘需要量。饲养3个月后，于大鼠内眦取血，测定血清甲状腺素，当各甲低组大鼠血清总三碘甲状腺原氨酸（TT3）、总甲状腺素（TT4）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）及游离甲状腺素（FT4）水平与对照组比较差异有统计学意义时，表明甲低模型复制成功。然后将甲低组随机分为甲低和甲低孕鼠妊娠1～17 d（孕早期甲低）补充甲状腺素高、中、低剂量组，甲低孕鼠妊娠18～20 d（孕晚期甲低）补充甲状腺素高、中、低剂量组，每组15只。高、中、低剂量组每天每100 g体质量分别补充甲状腺素3.5、2.0和0.5 μg。将8组雌鼠与正常Wistar雄性大鼠（食用正常饲料）按1∶1进行交配。次日晨检测阴栓，做阴道涂片，发现精子确定为妊娠0 d，8组孕鼠分别取孕17 d、新生当天、生后20 d的子鼠间脑组织，液氮速冻后，-80℃保存备用。

1.2 主要仪器与试剂 Taq DNA聚合酶、dNTPs、T4DNA连接酶、EcoRⅠ、pGEM®-T Easy Vector（美国Promega公司）；二硫苏糖醇（DTT）、Trizol、M-MLV、RNA酶抑制剂、SYBR®Green Mix（美国Invitrogen公司）；DNA Marker DL-2000、DNA纯化回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；引物合成和测序由上海博亚生物公司完成。Contifuge 17RS台式冷冻离心机（德国Heraeus公司）；实时荧光定量聚合酶链反应（Real time-PCR）仪购自LightCycler，瑞士Roche公司。

1.3 总RNA提取和cDNA合成 分别取孕17 d、新生当天、生后20 d子鼠间脑组织100 mg，采用Trizol一步法提取脑组织总RNA，利用分光光度计，在波长为230、260、280 nm时，测定总RNA的吸光度（A）值，当A260/A280为1.7～2.0、A260/A230为1.5～1.9时，说明总RNA纯度较高，基本去除了蛋白质和糖类等其他物质的污染。各管分别加入2 μg总RNA样品，用Oli⁃go（dT）181 μL（1 g/L）、dNTPs 1 μL（10 mmol/L）和DEPC水补齐至总体积12 μL。混匀后10 000 r/min瞬时离心5 s，65℃5 min后立即冰浴；加入5×Buffer 4 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL，RNA酶抑制剂1 μL（40 U），混匀，37℃2 min，立即冰浴，再加入M-MLV 1 μL（200 U），总体积20 μL。混匀，10 000 r/min瞬时离心5 s，37℃50 min，70℃15 min，-20℃保存。

1.4 实时荧光定量聚合酶链反应（Real time-PCR） 各引物序列利用Gene Runner软件设计，经NCBI BLAST检索无显著同源性序列。Nkx2.2引物：上游5-GCCTCCAATACTCCCTG CAC-3，下游5-CTCGTAG GTCTGCGCTTTG-3，扩增片段长度为182 bp；管家基因GAPDH：上游5-ACAGCAACTCCCAT TCTT-3，下游5-TCCAGGGTTTCTTACTCC-3，扩增片段长度为160 bp。依据总RNA的质量，将cDNA稀释成每微升所含cDNA量来源于20 ng总DNA。PCR反应体系：总体积20 μL，含SYBR®Green MIX 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 2 μL，双蒸水7.0 μL；反应条件：95℃3 min；95℃5 s，61℃10 s，72℃15 s，40个循环。通过测定PCR产物的动态累积量，获得样品的扩增曲线。然后进行融解曲线分析：95℃0 s，65℃15 s，95℃0 s，用待测样品2-△Ct值表示目的基因相对表达量，Ct是每个反应管内的荧光信号到达一定阈值时所经历的循环数；样品△Ct=目的基因Ct值-GAPDH Ct值。1.5 构建大鼠Nkx2.2反转录产物克隆载体 回收纯化的Nkx2.2 cDNA扩增产物，在T4DNA连接酶作用下，克隆入pGEM®-T Easy Vector，连接产物转化感受态DH5α，抗生素筛选阳性菌落。提取质粒DNA，用限制性内切酶EcoRⅠ（pGEM®-T Easy Vector的A-T连接位点两侧各有1个EcoRⅠ位点）进行酶切鉴定，筛选有DNA片段插入者进行序列测定。1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计处理，数据以±s表示，采用单因素方差分析，每个时间点不同组的两两比较采用Dunnett-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Nkx2.2扩增产物的鉴定 重组克隆载体pGEM-Te/Nkx2.2经EcoRⅠ酶切电泳后可清晰见到约182 bp处出现目的条带，同时3 000 bp处有质粒片段，见图1。

图1 pGEM-Te/Nkx-2.2酶切结果琼脂糖凝胶电泳图

2.2 Real time-PCR结果 Nkx2.2和GAPDH的扩增和融解曲线见图2。在孕17 d，甲低组的Nkx2.2 mRNA表达水平低于对照组，其他6个补充甲状腺组的mRNA表达水平均高于对照组；在新生当天和生后20 d，除孕晚期甲低补充甲状腺素中剂量组外，其他各甲低组的Nkx2.2 mRNA表达水平均低于对照组；在生后20 d，孕早期甲低补充甲状腺素低、中、高剂量组的Nkx2.2 mRNA表达水平与甲低组差别无统计学意义（P＞0.05）。各组组内不同时期基因表达情况比较差异均有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 8组大鼠脑组织中Nkx2.2 mRNA表达情况（n=15，×10-5，±s）

表1 8组大鼠脑组织中Nkx2.2 mRNA表达情况（n=15，×10-5，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 孕17 d 新生当天 生后20 d F对照组（1）甲低组（2）孕早期甲低低剂量组（3）中剂量组（4）高剂量组（5）孕晚期甲低低剂量组（6）中剂量组（7）高剂量组（8）F t（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（1）∶（6）（1）∶（7）（1）∶（8）（2）∶（3）（2）∶（4）（2）∶（5）2.24±0.14 1.53±0.30 18.90±5.11 3.16±0.15 26.10±7.43 8.09±7.01 39.03＊＊7.04＊＊4.58±1.27 3.97±2.94 7.87±3.67 1.32±0.26 12.80±2.23 8.80±0.08 11.10±0.00 9.68±0.62 7.01±4.04 17.63＊＊13.16＊＊22.49＊＊14.22±10.30 14.90±10.31 15.30±10.10 7.08＊＊3.625＊4.977＊4.001＊10.830＊22.603＊＊24.800＊＊37.689＊＊6.385＊6.112＊6.106＊7.99±0.61 20.50±3.63 9.85±1.32 19.00＊＊56.092＊＊87.239＊＊21.660＊＊68.112＊＊55.670＊＊0.331 50.223＊＊13.730＊57.382＊＊19.008＊＊10.80±0.40 26.60±10.30 18.60±9.70 24.65＊＊101.573＊＊86.370＊＊90.022＊＊122.056＊＊78.933＊＊0.321 64.185＊＊0.411 0.347 0.386 15.18＊＊38.37＊＊12.24＊＊

3 讨论

脑在发育时期是甲状腺素的一个靶器官。缺碘对处于发育中的脑可造成不可逆转的损害，这种损害与宫内胚胎发育的特定阶段具有极其密切的关系。同源盒基因是首先在果蝇中发现的由180～183个碱基组成的保守序列，该序列编码的60～61个氨基酸所构成的多肽区域，称为同源结构域或同源盒，为DNA结合蛋白，能调节其他基因的表达。同源盒基因Nkxs与神经系统的分化与发育关系极为密切。它们大都只是在胚胎发育期表达，出生后很少表达甚至不再表达[6]。Nkx2.2基因是Nkxs家族中的重要一员，它主要表达于腹侧中枢神经系统及胰腺。研究发现，Nkx2.2基因敲除小鼠的髓鞘碱性蛋白（MBP）阳性与髓鞘蛋白脂质蛋白（PLP）阳性的少突胶质细胞出现显著延迟，而且数量明显减少[7]。可见在脑和脊髓中，Nkx2.2同源转化盒基因对少突胶质细胞的分化和成熟有着重要的调节作用[8]。在本实验脑组织取材部位定为单侧大脑半球中1/3腹侧处，即间脑组织，利用Real time-PCR技术对不同给药剂量甲低孕鼠的子代大脑组织Nkx2.2的表达进行测定。发现在孕17 d、新生及生后20 d甲低组Nkx2.2的表达水平均低于对照组。在不同时期给予孕鼠不同剂量的甲状腺素对Nkx2.2表达量有较大的影响。其中，在低碘孕鼠的孕晚期给予中等剂量的甲状腺激素可以使Nkx2.2的表达水平得到明显改善，并与对照组同时期水平接近。笔者推测，低碘导致的脑发育迟滞可能与Nkx2.2表达量的缺乏有关，而在孕晚期给予中等剂量甲状腺素可以使甲状腺功能低下的孕鼠的子代达到正常的基因表达量，能够起到很好的治疗效果。此项研究侧重于分子机制方面的基础研究，对妊娠早期常规筛查和监测孕妇的甲状腺激素水平能起到一定的指导作用，并为孕期防治新生儿甲低提供理论支持。关于甲状腺激素和同源盒基因Nkx2.2之间调控表达的具体作用机制仍有待于进一步研究。

[1]Bober E,Braum T,Arnold HH.A novel NK-related mouse homeo⁃box gene:ex-pression in central and peripheral nervous structures during embryonic development[J].Dev Biol,1994,162(1):288-303.

[2]李敬华，张瑞，汪蓓蕾，等.甲状腺功能减低孕鼠补充甲状腺素对子代脑组同源盒基因Nkx2.1mRNA表达的影响[J].中华预防医学杂志，2010，44(8)：726-730.

[3]娜仁，张瑞，汪蓓蕾，等.甲状腺素对甲状腺功能减低大鼠子代脑组织中同源盒基因Nkx6.1 mRNA表达的影响[J].中国地方病杂志，2010，29(2)：150-154.

[4]Doyle MJ,Loomis ZL,Sussel L.Nkx2.2-repressor activity is suffi⁃cient to specify alpha-cells and a small number of beta-cells in the pancreatic islet[J].Development,2007,134(3):515-523.

[5]Quinn JC,Molinek M,Martynoga BS,et al.Pax6 controls cerebral cortical cell number by regulating exit from the cell cycle and speci⁃fies cortical cell identity by a cell autonomous mechanism[J].Dev Biol,2007,302(1):50-65.

[6]Qi Y,Cai J,Wu Y,et al.Control of oligodendrocyte differentiation by the Nkx2.2 homeodomain transcription factor[J].Development, 2001,128(14):2723-2733.

[7]Fu H,Qiu M.Migration and differentiation of Nkx-2.2+oligodendro⁃cyte progenitors in embryonic chicken retina[J].Brain Res Dev Brain Res,2001,129(1):115-118.

[8]Liu Y,Wu Y,Lee JC,et al.Oligodendrocyte and astrocyte develop⁃ment in rodents:an in situ and immunohistological analysis during embryonic development[J].Glia,2002,40(1):25-43.