CaMKⅡ在收缩促进骨骼肌细胞GLUT4转位中的作用*

于俊娜 牛文彦

骨骼肌是摄取葡萄糖维持血糖稳态的重要器官，胰岛素和骨骼肌收缩以不同的信号机制促进胞浆中的葡萄糖转运子4（glucose transporter 4，GLUT4）转位到细胞膜上增加葡萄糖摄取量[1]。氨乙酰胆碱（Carbachol，Cch）是乙酰胆碱的稳定类似物，可去极化骨骼肌细胞膜，造成收缩[2]。在培养的小鼠C2C12骨骼肌细胞中使用Cch可模拟运动的作用[3]。Ca2+通过许多钙敏感激酶进行信号传导。本研究通过测定C2C12小鼠骨骼肌细胞膜上的GLUT4myc的水平和钙-钙调素依赖型蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）的磷酸化水平，探讨CaMKⅡ在收缩的骨骼肌细胞中促进GLUT4myc转位的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 C2C12 GLUT4myc骨骼肌细胞株由本实验室建立，Hanks液、DMEM（天润善达公司），胎牛血清（以色列Bioind公司），马血清（美国Gibco公司），Blasticidin-HCl（德国Calbio⁃chem公司），抗myc抗体（美国Sigma公司），偶联辣根过氧化物酶（HRP）的山羊抗兔抗体（美国Jackson Immuno Research公司），抗磷酸化CaMKⅡ抗体（美国Cell Signaling公司），偶联HRP的山羊抗兔抗体、驴抗鼠IgM抗体（美国Jack son Immu⁃noResearch公司），增强化学发光底物检测试剂盒（美国Milli⁃pore公司）。KN93、KN62（加拿大Calbiochem公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，在37℃，体积分数为0.05的CO2条件下培养C2C12 GLUT4myc成肌细胞，将成肌细胞接种到培养板中，用含5%马血清的DMEM高糖培养基诱导分化为多核肌管，每2 d换液，于第5天用于实验。将培养板中的细胞无血清培养4 h后随机分为对照组和Cch组，分别加入无血清培养基或100 μmol/L的Cch孵育10 min。各组分为抑制剂亚组和对照亚组，分别用于测定细胞膜上GLUT4myc的水平及检测CaMKⅡ的磷酸化。

1.2.2 酶联免疫吸附法（ELISA）测定细胞膜上GLUT4myc的水平 抑制剂亚组加入10 μmol/L抑制剂KN93或KN62于处理前30 min预孵育细胞。每亚组设3个平行复孔。处理细胞后，多聚甲醛固定，甘氨酸淬灭，5%（V/V）的脱脂牛奶封闭后，用抗myc抗体室温孵育1 h；用偶联过氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG室温孵育1 h；加入底物邻苯二胺溶液，反应约20 min后终止，用酶标仪测定上清液492 nm的吸光度值，重复4次。

1.2.3 Western blotting法检测CaMK II的磷酸化 抑制剂亚组将10 μmol/L的KN93提前30 min加入细胞预孵育。处理细胞后，裂解细胞，65℃加热15 min，体积分数为0.075的SDS-PAGE电泳，免疫印迹检测CaMKⅡ的磷酸化，一抗用CaMKⅡ磷酸化抗体，二抗用偶联HRP的山羊抗兔抗体，以Actinin1作为内参，增强化学发光底物试剂盒检测，曝光，重复4次。结果用Image J软件处理。

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件包进行统计学分析。所有实验数据均以均数±标准差（±s）表示，用单因素方差分析比较3组均数间的差异，3组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞表面GLUT4myc水平的比较 Cch使细胞膜上GLUT4myc的水平显著增加（P＜0.01）。CaMKⅡ抑制剂KN93和KN62不影响对照组细胞膜上GLUT4myc的水平（P＞0.05），但抑制Cch组中对照亚组细胞膜上GLUT4myc的表达（P＜0.05或P＜0.01），见表1、2。

2.2 KN93对CaMKⅡ磷酸化的影响 Cch可增加CaMKⅡ的磷酸化，KN93不影响对照组CaMKⅡ的磷酸化水平，但可以抑制Cch刺激的CaMKⅡ磷酸化（P＜0.01），见表3、图1。

表1 KN93对各组中细胞表面GLUT4myc水平的影响（n=12，±s）

表1 KN93对各组中细胞表面GLUT4myc水平的影响（n=12，±s）

＊＊P＜0.01

组别 相对于对照组中对照亚组的倍数统计学处理组比 P对照组 对照亚组（1）KN93亚组（2）Cch组 对照亚组（3）KN93亚组（4）F 1.00±0.00 1.09±0.10 1.74±0.14 1.24±0.02 46.007＊＊（1）∶（2）（1）∶（3）（3）∶（4）0.242＜0.001＜0.001

表2 KN62对各组中细胞表面GLUT4myc水平的影响（n=12，±s）

表2 KN62对各组中细胞表面GLUT4myc水平的影响（n=12，±s）

＊＊P＜0.05

组别 相对于对照组中对照亚组的倍数统计学处理组比 P对照组 对照亚组（1）KN62亚组（2）Cch组 对照亚组（3）KN62亚组（4）F 1.00±0.00 1.16±0.19 2.46±1.00 1.80±0.75 3.973＊＊（1）∶（2）（1）∶（3）（3）∶（4）0.756 0.009 0.035

表3 CaMKⅡ磷酸化水平倍数的比较（n=4，±s）

表3 CaMKⅡ磷酸化水平倍数的比较（n=4，±s）

＊P＜0.05

组别 相对于对照组中对照亚组的倍数统计学处理组比 P对照组 对照亚组（1）KN93亚组（2）Cch组 对照亚组（3）KN93亚组（4）F 1.00±0.00 1.19±0.41 2.98±1.54 1.27±0.18 5.24＊（1）∶（2）（1）∶（3）（3）∶（4）0.750 0.004 0.007

图1 KN93对C2C12GLUT4myc骨骼肌CaMKⅡ磷酸化的影响

3 讨论

胰岛素刺激GLUT4从胞浆的储存囊泡（GLUT4囊泡）转位到细胞膜上转运葡萄糖进入细胞，从而促进骨骼肌摄取葡萄糖。运动时肌肉收缩是另一个重要的生理性刺激，促进GLUT4转位到细胞膜[4]。本研究采用Cch孵育C2C12骨骼肌细胞，模拟运动的作用，通过测定C2C12 GLUT4myc小鼠骨骼肌细胞膜上GLUT4myc的水平和CaMKⅡ的磷酸化，探讨CaMKⅡ在收缩刺激骨骼肌细胞GLUT4myc转位机制中的作用。

Cch通过激活乙酰胆碱受体和继发的Na+的流入，诱导间接去极化，动作电位改变二氢吡啶受体的构象，开放肌浆网Ca2+释放通道，将Ca2+释放入胞浆，Ca2+浓度升高从而触发收缩[5]。笔者的前期工作显示Cch能快速升高骨骼肌细胞胞浆Ca2+浓度[3]。肌肉收缩导致细胞GLUT4转位的信号机制还不明确，但可以确定的是Ca2+信号和腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是收缩促进骨骼肌摄取葡萄糖的两个重要的信号机制[6-7]。

C2C12骨骼肌细胞表达CaMKⅡ，本研究显示Cch显著增加细胞膜上的GLUT4myc水平和CaMKⅡ的磷酸化水平，表明Cch促进GLUT4myc转位并激活CaMKⅡ。抑制CaMKⅡ的磷酸化可抑制Cch增加的细胞膜上GLUT4myc水平，提示CaMKⅡ介导收缩促进GLUT4myc转位的作用。GLUT4处于由胞浆向胞膜外排并由胞膜内吞进入胞浆的动态平衡中，降低GLUT4的内吞或加快GLUT4的外排均可导致细胞膜上的GLUT4数量增加。胰岛素促进骨骼肌葡萄糖摄取主要通过增加GLUT4外排。另外胞浆Ca2+浓度升高，可促进大鼠骨骼肌L6细胞中GLUT4的外排，并抑制其内吞，增加骨骼肌葡萄糖的摄取，亦由CaMKⅡ介导。而收缩如何调节GLUT4的运输，CaMKⅡ在其中的作用如何则有待进一步研究。

糖尿病患者存在胰岛素分泌障碍和作用缺陷，而收缩可促进骨骼肌摄取葡萄糖，具有胰岛素替代作用，运动对血糖调节发挥重要作用。因此研究阐明运动/肌肉收缩调节GLUT4转位和葡萄糖摄取的机制有助于改善胰岛素抵抗、预防和治疗糖尿病。

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