水蛭肽注射液对大鼠脑神经细胞凋亡的影响

闫珊珊

脑血管病是威胁人类健康的常见疾病之一，具有发病率高、死亡率高、致残率高及复发率高的特点。缺血性脑血管病病理基础与缺血后引起的神经元坏死和迟发性神经元死亡密切相关。其治疗主要是溶栓、应用神经保护剂（包括谷氨酸拮抗剂、钙通道阻滞剂等）、外科治疗等。虽然取得了一定疗效，但因缺乏满意效果或安全性使其临床应用受到限制。

水蛭肽注射液经初步研究显示其具有抗血小板聚集和血栓形成的作用[1]，有研究表明水蛭肽注射液对脑缺血性脑损伤有明显的保护作用[2]，可减轻脑水肿、改善脑组织学形态结构、改善脑能量代谢等，但水蛭肽注射液对神经细胞凋亡作用的研究尚未见报道。本研究从分子生物学角度出发，观察不同剂量水蛭肽注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响，进一步探讨水蛭肽注射液对脑缺血再灌注损伤的作用机制，为水蛭肽注射液治疗缺血性脑血管疾病提供更可靠的理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

健康Wistar大鼠60只，雌雄不限，体重250～320克，由广西中医学院实验动物中心提供。饲养环境室温25℃，空气新鲜，动物自由饮水、摄食。

1.2 实验药物

水蛭肽注射液：每支2ml，（每ml含生药1g）由广西中医学院第一附属医院制剂室制备，批准文号：桂卫药制字（1998）005091.批号：031112-1。

1.3 实验试剂

Hoechst33258细胞凋亡染色试剂盒（100x），由江苏南通碧云天生物技术研究所购买，为Sigma公司产品。

TTC液，购自上海生物工程技术服务有限公司。

2 实验方法

2.1 实验动物分组法

把60只大鼠按照随机、对照、均衡的原则，采用随机数字表将大鼠分为5组，分别为假手术组，生理盐水对照组，川芎嗪对照组，水蛭大、小剂量组，每组各12只。除假手术组外，其余四组均制备脑缺血再灌注损伤模型，生理盐水对照组给予生理盐水注射，假手术组在手术操作过程中，除不结扎颈总动脉外，其余处理方法同生理盐水对照组。

2.2 实验动物给药方法

参照《中医动物实验方法学》的方法计算给药，详见表1。

2.3 大鼠大脑中动脉栓塞及再灌注模型的制备

60只健康Wistar大鼠，参照Nagasawa[3]栓线法并加以改进，阻塞大鼠大脑中动脉，制作大鼠脑缺血再灌注损伤模型。假手术组做手术但栓线仅插入颈外动脉[4]。

2.4 标本采集

各组动物于脑缺血再灌注22h后，快速断头取脑，经视交叉吻端冠状切开脑组织，制作脑部冠状切片，片厚约4μm 。

2.5 缺血后神经功能评分

各组动物均栓塞左侧MCA，缺血2h再灌注12h后，再次麻醉动物，麻醉前分别采用5分制进行神经功能评分[5]。

0级：正常；

Ⅰ级：右前爪不能完全伸展；

Ⅱ级：行走时向右侧转圈；

Ⅲ级：站立行走时向右跌倒；

Ⅳ级：无自发活动及意识水平下降。

2.6 神经细胞凋亡的检测

2.6.1 脑组织神经细胞凋亡的形态观察

采用Hoechst染色法[6-7]检测神经细胞凋亡，具体方法如下：

脑缺血再灌注24h后，快速断头取脑，制作脑部冠状切片，进行Hoechst染色。用荧光显微镜进行检测，观察神经细胞凋亡的形态。

2.6.2 大鼠脑组织神经细胞凋亡的百分率计算

选取Hoechst染色后的脑组织切片，在荧光显微镜下观察大鼠脑组织，用显微成像系统分析计算上述脑组织神经细胞凋亡的百分率。

2.7 统计方法

3 实验结果

3.1 水蛭肽注射液对MCAO模型大鼠神经功能评分的影响

根据Zealonga的方法，将制作成大脑中动脉脑缺血再灌注（MCAO）模型的大鼠采用5分制进行神经功能评分。缺血前及再灌注损伤后给予水蛭肽注射液或川芎嗪腹腔注射的大鼠，其神经功能评分均能明显降低（P＜0.01），水蛭肽注射液大小剂量组与川芎嗪组相比差异均有显著性（P＜0.01，P＜0.05），但水蛭大剂量组的大鼠神经功能评分的大鼠神经功能评分与除假手术组之外的其余各组相比差异均有显著性（P＜0.01）。各组大鼠神经功能评分详见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分的比较（）

表1 各组大鼠神经功能评分的比较（）

3.2 水蛭肽注射液对MCAO模型大鼠脑神经细胞凋亡率的影响

3.2.1 Hoechst33258染色法检测神经细胞凋亡时荧光显微镜观察结果

经Hoechst33258染色法染色后，用荧光显微镜观察，结果显示，大脑皮质正常神经细胞与凋亡细胞均发出蓝色荧光，但大脑正常组织细胞核呈弥散、微弱、均匀分布；而凋亡神经细胞的细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒凝快状荧光及明显核形态变化，发出强亮的荧光，如果在视野中见到3个或以上的DNA荧光碎片即可被认为是凋亡细胞。图片可见生理盐水对照组在脑缺血再灌注损伤22h后细胞凋亡数目明显增加，水蛭大小剂量组和川芎嗪组在脑缺血再灌注损伤22h后细胞凋亡数目较生理盐水对照组明显减少。

3.3.2 各组大鼠脑神经细胞凋亡百分率的比较

脑缺血再灌注22h后，给予水蛭肽注射液或川芎嗪腹腔注射的大鼠，与生理盐水对照组相比较，其脑神经细胞凋亡率均能明显降低（P＜0.01），水蛭肽注射液大、小剂量组与川芎嗪组相比差异均有显著性（P＜0.01），但水蛭大剂量组与水蛭小剂量组相比差异亦有显著性（P＜0.01）。各组大鼠脑神经细胞凋亡率详见表2。

表2 各组大鼠脑梗死面积百分比及左侧大脑半球脑神经细胞凋亡百分率（）

表2 各组大鼠脑梗死面积百分比及左侧大脑半球脑神经细胞凋亡百分率（）

4 讨论

缺血性脑血管病属中医“中风”的范畴，随着对中风病研究的不断深入，中医药对中风发病机制及临床治疗效果均有所发展和进步。中医治疗缺血性中风常用的方法有活血化瘀法、化痰通络法、益气活血法、益肾通络法、祛风通络法、通腑泻热法、养阴活血法、清热解毒法等[8]，但中医认为中风的病机关键是瘀血，“瘀血不去，则出血不止，新血不生”，“凡血证总要以去瘀为要”，活血化瘀法是治疗中风病的根本大法。

水蛭肽注射液是集多年临床经验研制而成的治疗脑血管病的中药制剂，经初步研究显示其具有抗血小板聚集和血栓形成的作用，有研究表明水蛭肽注射液对脑缺血性脑损伤有明显的保护作用[2]。具有减轻脑水肿、改善脑组织学形态结构、改善脑能量代谢等作用。

本实验中采用线栓法阻断MCA，方法更为简单，对脑组织的直接损伤小，能阻断豆纹动脉和其它直接从MCA发出的小皮层支，与临床上脑梗塞发生的常见类型相似，便于制作脑缺血后再灌注动物模型；采用脑缺血2h后再灌注模仿临床治疗时间窗，更加符合临床药物治疗研究实际。中医认为“缺血性脑卒中”的病机关键是瘀血，治疗应以活血化瘀为主，水蛭肽注射液可以活血化瘀，于MCA阻塞前3天，再灌注之始给予水蛭肽注射液，是模拟临床上“预防窗”、“脑缺血超早期干预窗”而设计的，此时给药可改善脑部微循环，抗血小板聚集，提高脑能量代谢，防止形成内结毒瘀的状态，阻止其对缺血损伤的神经元产生不利作用。

本实验结果表明，各实验组缺血2小时后实行再灌注均存在神经细胞凋亡，但在量上存在明显差异。假手术组可见少数细胞凋亡，这与其他研究结果基本一致，这可能是脑组织生长发育过程中一种生理性死亡及手术刺激引起的凋亡。生理盐水对照组细胞凋亡发生率明显增加，给予水蛭肽注射液后凋亡率显著下降，水蛭小剂量组对神经细胞凋亡有一定的抑制作用，水蛭大剂量组可显著抑制神经细胞的凋亡。说明水蛭肽注射液对脑缺血再灌注后神经细胞有明显的保护作用，从而减轻脑缺血再灌注损伤。水蛭肽注射液抗细胞凋亡作用可能与清除氧自由基及促使凋亡抑制基因表达有关，但其抑制细胞凋亡的确切机制有待于进一步研究。

[1]王晓明,吴岩，邱智东,等.水蛭肽注射液对大鼠血小板凝聚及血栓形成的影响[J].中成药,1998,20(4):27-28.

[2]董少龙,刁丽梅,窦维华.水蛭肽注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的防治作用及其机制[J].广西中医药, 2004, 14(01): 47-50.

[3]Nagasawa H, Kogura K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion[J].Stroke, 2001, 20: 1037.

[4]赵应敏,宋波,许予明.脑心通对缺血再灌注大鼠脑水肿的影响[J].当代医学, 2009,15(16): 143-144.

[5]Zealonga E, Weinstein P R, Carlson S, et al.Reversible middle cerebral attery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke, 2006, 20:84.

[6]胡野,凌志强,单小云.细胞分子医学[J].军事医学科学出版社,2002,471-475.

[7]李晓军,武建国.细胞凋亡检测的研究进展及其与疾病的关系[J].临床检验杂志,1999,17(1):53-56.

[8]刘亚敏,徐秋英.中医药治疗缺血性中风的现状[J].长春中医学院学报,2002,18(2):57-58.