微结构芯片对石墨粉吸附及3种口腔微生物黏附行为的影响

邱瑜蕾 周学东 包崇云

（1.口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学，成都 610041；

2.苏州市华夏口腔医院，苏州卫生职业技术学院 牙体牙髓科，苏州 215002）

微结构芯片对石墨粉吸附及3种口腔微生物黏附行为的影响

邱瑜蕾1，2周学东1包崇云1

（1.口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学，成都 610041；

2.苏州市华夏口腔医院，苏州卫生职业技术学院 牙体牙髓科，苏州 215002）

目的 通过制备精确控制微结构的材料样品，比较不同尺寸无生命物质的吸附行为及不同尺寸微生物的黏附行为，探讨微结构影响微生物黏附增殖的机制。方法 聚二甲基硅氧烷（PDMS）翻制羟磷灰石（HA）芯片上的23个微结构，并分别与不同尺寸的石墨粉和不同尺寸的口腔微生物共培养，观察并比较微结构大小及形状对石墨粉吸附和微生物黏附的影响。结果 30～50μm的石墨粉在各尺寸微结构上的吸附量无显著差异，10～20μm的石墨粉在10μm和20μm的结构上吸附量最多；白假丝酵母菌最易黏附于尺度与其大小相当的5μm微结构区。微结构对呈链状生长的变异链球菌黏附影响不大。结论 微结构对无生命物质的吸附与二者的尺度大小呈正相关，对微生物的黏附也产生同样影响，即与大小尺度呈正相关性；但一些特殊增殖行为的细菌，如呈链状生长的变异链球菌，微结构形状及尺度大小对其黏附影响较小。

微结构芯片； 石墨粉； 口腔微生物

种植义齿是采用人工种植体植入颌骨获取固位支持的修复体，与传统义齿比较具有固位好、咀嚼效率高、美观舒适等特点。实际应用中，细菌在基桩表面的初期黏附与随后的大量增殖引起的种植体周围炎是该类义齿的主要并发症[1]。因此要保证种植体长期的临床应用成功，促进软组织封闭及阻止细菌在基桩表面的黏附与增殖是非常重要的。理想的种植体穿黏膜部分的表面应该不仅允许上皮和结缔组织附着，而且应该同时把细菌黏附降到最小程度。种植体穿龈部位的化学组成、表面物理形貌决定细菌及软组织的黏附及附着行为，并影响软组织与植入体间密封[2-5]。关于物理形貌，多数学者主张该部位应具有相对光洁的表面，但什么特征的表面形貌结构利于软组织生物密封目前不清。本课题组前期研究发现：细胞易于在亚微米结构附着、增殖，细菌易于在微米结构黏附、增殖。但究竟是细胞、细菌自身尺寸大小影响了它们对不同尺度结构的附着和黏附，还是因为它们具有不同的生物学行为目前尚不清楚。因此，本实验选择将无生物学行为的无生命微粒在微结构上的吸附行为与有生物学行为的微生物在微结构上的黏附行为进行比较，探究微生物本身的物理特性和生物学特性对其黏附行为的影响情况，初步探讨优化种植体颈部光滑表面特性的可行办法。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）芯片（由荷兰的屯特大学实验室提供），聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）试剂（SYLGARD-184，美国道康宁公司），石墨粉（青岛申墅石墨制品有限公司），变异链球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）ATCC 25175、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）ATCC 6538和白假丝酵母菌（Saccharomyces albicans，S.albicans）ATCC 10231标准菌株（四川大学口腔疾病研究国家重点实验室微生物教研室提供），85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器厂），SW-CJ-ZF超净工作台（苏州净化有限公司），HITACHI53400扫描电子显微镜（scanning electronic microscope，SEM）（日本日立公司）。

1.2 方法

1.2.1 微米结构芯片样品的制备 HA芯片是规则地划分有23个大小为400μm×400μm微结构的HA芯片，其中1个区域为对照，其余尺度分为1、3、5、10μm[6]；深度与制备尺度相当；微结构间的间距分别有10和20μm两种；形状为线条、交叉线条、圆孔和三角形的微结构。首先将PDMS与促凝剂按10∶1调合，倾倒入装有HA微结构芯片的培养皿中，负压抽吸去除其内气泡，置于70℃烘箱内1 h，即翻制形成阴模。阴模表面喷金，再用PDMS翻模，最终形成与HA微结构模式一致的微结构芯片样品。用SEM分析PDMS翻制的阴、阳模样品微结构形貌。

1.2.2 微米结构芯片对石墨粉吸附行为的影响 电子称称量粒度分别为1、10～20、30～50μm的石墨粉（由于超微粒制作工艺的因素，本实验中所指1μm微粒实际尺度其实小于等于1μm），并用蒸馏水配制质量/体积比为1∶80 000的悬浊液，磁力搅拌器搅拌30min见悬浊液混合均匀后，放入模型，静置于37℃培养箱中，30min后取出。用PBS液冲洗3～4次，晾干后光镜及SEM下观察。

1.2.3 微米结构芯片对3种微生物黏附行为的影响菌种复苏后，用广口烧瓶对PDMS材料样品与细菌悬浊液培养，S.mutans、S.albicans及S.aureus的接种数量分别为1.8×109、8.5×108和1.8×108CFU·mL-1。分别培养48 h及72 h后，处理样本后在SEM下观察细菌黏附情况，并定量计数。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0软件包对数据进行处理，取得均数及标准差，并绘制柱形图。因有尺寸和间隔距离的变化，对同一形状的微结构可进行两因素方差分析。

2 结果

2.1 PDMS模型SEM分析

PDMS模型SEM分析图见图1，用模子复制技术在PDMS这种高分子材料上可制造与母模相同的清晰的微米结构，为下一步实现高通量筛选分析微结构对细菌行为影响方面的研究提供高效廉价的样本。

图1 翻制的PDMS模型上的三角形（A）、直线形（B）、圆形（C）和交叉形（D）微结构Fig 1 Triangle（A）,linear form（B），round（C）and cross-shaped（D）microstructures on the PDMSmodel

2.2 石墨粉实验结果

30～50μm的石墨粉在阴模与阳模上吸附量差异不大（图2）。10～20μm石墨粉在阴模上吸附量多于阳模（图2）。1μm石墨粉在空白对照区吸附量最大（图3），说明超微粒具有极强的吸附性，容易成团簇性吸附于空间区域较大的地方。

2.3 口腔微生物实验结果

S.albicans在有微结构的区域，菌细胞优先聚集在沟槽、凹陷内，因不同形状的微结构排列成团块状、串珠状等；而且，细菌最容易黏附生长于尺度与其大小最接近的5μm的微结构中（图4）。S.mutans在材料上的黏附量比其他菌种显著减少，细菌成短链状生长在模型的各个区域，不受微结构的形状影响。但随着培养时间的延长，在空白区黏附增殖量明显多于微结构区（图5）。S.aureus在较小微结构中呈单个散在分布，微结构尺寸与细菌相当时，菌量最多；在空间较大的结构区，菌细胞优先成葡萄串珠样或团块状聚集，且随着微结构尺寸的增大，菌量增加。

图2 10～20μm的石墨粉在各微结构上的吸附量（上）；30～50μm的石墨粉在各微结构上的吸附量（下）Fig 2 Adsorption of 10-20μm graphite powder on differentmicrostructures（up）.Adsorption of 30-50μm graphite powder on different microstructures（down）

图3 1μm的石墨粉在各结构上的吸附量Fig 3 Adsorption of 1μm graphite powder on different structures

图4 S.albicans在各微结构上的黏附量Fig 4 Adsorption of S.albicans on different microstructures

图5 S.mutans在各微结构上培养不同时间的黏附量Fig 5 Adsorption of S.mutans on different microstructures cultured by different times

3 讨论

生物材料的表面特性（包括物理形貌和化学组分）决定着细胞和细菌的附着和黏附[7-10]。光滑的基桩表面有利于减少细菌的黏附，但并非越光滑越好，因为太过光滑的基桩表面并不利于软组织的附着并形成良好的生物封闭。已有研究[11]表明：如果表面特征尺寸远远大于微生物尺寸，则不会有明显的微生物滞留；但是如果两者尺寸相当，那么微生物的滞留量就会增加。基于此，本实验设计了多种形状、不同尺寸的微米结构来初步观察口腔微生物的黏附是否受特征结构的形状和大小的影响，并将其与无生物学行为的微粒的吸附行为进行比较，以探讨生物学行为在微生物黏附中的特殊作用。

用于微结构研究的基质包括陶瓷、硅、玻璃或者高分子材料等。本实验的母模以HA为基质，因为HA具有良好的生物相容性，不仅广泛用于穿皮/穿龈植入式器件的骨内段，同时也用于基桩部分的制作。但由于本实验需要很多样本，而在HA上激光消融制作微结构耗时耗力，因此选用高分子材料PDMS来翻制HA芯片，模拟基桩表面微结构。PDMS不但具有良好的生物相容性，低毒性，高氧化性和热稳定性，并且廉价，弹性、流动性和操作性能好，可以精确翻制HA模型上的微结构，另外它的透明材质方便在光镜下做初步模型观察和筛选。

在种植体的临床应用中，基桩周围组织感染是最常见的并发症[12]。口内穿龈器件周围感染时，检测出的细菌以厌氧菌为主[13]。本实验的研究菌株既要考虑其在口腔环境中的致病性，又要考虑菌体大小差异以比较不同大小的细菌对不同尺寸的微结构的黏附有无差异；因此，本实验选择口内的主要致病菌S.mutans（直径0.5～0.75μm）以及与其体积相差较大的口腔常见致病真菌S.albicans（直径2～4μm）。此外，由于S.mutans成链状生长，为了减少生长特性对实验结果的影响，故设金黄色葡萄球菌为另一实验对象以作对比。本实验中，3种微生物的初始密度（S.mutans1.8×109、S.albicans8.5×108、S.aureus1.8× 108CFU·mL-1）是根据预实验结果选择的最佳密度。由于本实验只进行同种微生物间的比较，所以三者初始数据虽不一致，但并不影响实验结果。究其原因，S.mutans为厌氧菌，较为脆弱，所以密度最大；而S. albicans为真菌，增殖速度较慢，在培养相同时间的前提下，只有增加密度才能得到较满意的增殖量。

本实验结果提示，当无生命微粒尺度远大于微结构时，后者对前者的吸附没有显著影响；大于1μm的微粒最易吸附于大小与其相当的微结构中，而小于1μm的微粒因其独特的超强吸附性，最易成团簇状吸附于空间较大的区域。成散在单个生长的细菌最易黏附于尺度与其大小相当的结构区；而成团状生长的葡萄球菌，容易黏附增殖于空间大的区域。微结构对非生命物质的吸附与二者的尺度大小呈正相关性，对微生物的黏附、增殖也产生同样影响，即与大小尺度呈正相关性；但一些特殊增殖行为的细菌，如呈链状生长的S.mutans微结构，微结构形状及尺度大小对其黏附、增殖影响较小。

本实验仅对单种菌生长时的黏附情况进行了观察，而口腔中牙菌斑生物膜是以生态群体的形式存在，各种细菌之间有着错综复杂的关系（如共生与竞争、依存与拮抗等），它们也影响着细菌的黏附和增殖。因此，下一步实验需选取多种种植体周炎的可疑致病菌共同培养，更加真实地模拟口腔细菌定植和增殖的群体模式，制作种植体颈部环形结构的HA模型，以期实验结果更接近临床环境的真实情况，进一步探讨细菌引起种植体周炎发生发展的机制。

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（本文编辑 汤亚玲）

Influence of m icro-pattern on adherence of graphite powder and three kinds of oral m icrobes

QIU Yulei1，2,ZHOU Xue-dong1,BAO Chong-yun1.（1.State Key Laboratory of Oral Diseases,Sichuan University,Chengdu610041,China;2.Dept.of Endodontics,Suzhou Huaxia Stomatological Hospital,Suzhou Health College,Suzhou215002,China）

ObjectiveTrying to find out the mechanism of microstructure influencing bacterial adhesion,we prepared different microstructures to compare the adsorptive behavior of graphite powder and adhesive behavior of oral microbe.MethodsWe used polydimethylsiloxane（PDMS）to copy 23 microstructures of hydroxyapatite（HA）chip,and cultured them with different sizes graphite powder and oralmicrobes respectively,to observe and compare their behavior on microstructures.Results The adsorption of 30-50μm powder on different microstructures was insignificant,while 10-20μm powder had maximum adsorption on 10μm and 20μm microstructures.Saccharomyces albicanswas most likely to adhere to 5μm microstructures which was equivalent to its own size.However,microstructures had little effect on adhesion ofStreptococcusmutanswhich grew in a chain.ConclusionThe size ofmicrostructure was themost effective factor that affects the adsorption of non-living powder,and it also had the same effect on the microbial adhesion;but some special bacteria,such asStreptococcus mutanswhich grew in a chain,was not affected by the sizes or shapes of microstructures.

micro-pattern chip； graphite powder； oral microbe

R 783.1

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.026

1000－1182（2011）03－0323-04

2010-10-27；

2011-02-21

国家自然科学基金资助项目（30970728）

邱瑜蕾（1985—），女，浙江人，助教，硕士

包崇云，Tel：028-85501233