磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白质丝氨酸-苏氨酸激酶信号通路与正畸牙移动的关系

刘奕 王岩 孙素芬

（中国医科大学口腔医院 奉天门诊，沈阳 110013）

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白质丝氨酸-苏氨酸激酶信号通路与正畸牙移动的关系

刘奕 王岩 孙素芬

（中国医科大学口腔医院 奉天门诊，沈阳 110013）

目的 探讨磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白质丝氨酸-苏氨酸激酶（AKt）信号通路与正畸牙移动的关系。方法 选用24只日本大耳白兔建立正畸牙移动的动物模型，将实验动物上颌右侧戴矫治器，作为实验侧；上颌左侧未戴矫治器，作为对照侧。分别在戴矫治器3、5、7、14 d后各处死6只实验动物。用实时荧光定量聚合酶链反应（RQ-PCR）及Western blot免疫印迹分析方法对PI3K、AKt表达的变化进行检测。结果 RQ-PCR结果显示：加力3 d后，牙周组织中PI3K、AKtmRNA表达增强；7 d后牙周组织中PI3K、AKtmRNA明显增强，随后缓慢下降，与对照侧相比，其差异有统计学意义（P＜0.05）。Western blot免疫印迹分析与RQ-PCR结果一致。结论 正畸力作用下兔牙周组织中PI3K、AKt的表达增加。提示PI3K/AKt信号通路与正畸牙移动有关，PI3K/AKt信号通路参与正畸牙移动过程中的牙周组织改建。

磷脂酰肌醇-3-激酶； 蛋白质丝氨酸-苏氨酸激酶； 实时荧光定量聚合酶链反应

磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白质丝氨酸-苏氨酸激酶（proteinserine-threonine kinase，AKt）信号通路激活主要促进细胞增殖、细胞迁移以及血管生成[1-2]。目前在肿瘤领域研究较多，但PI3K/AKt信号通路与正畸牙移动及牙周组织改建关系的研究尚未见相关报道。本研究通过建立动物模型，观察PI3K、AKt在牙周组织中的表达变化，探讨PI3K/AKt信号通路在正畸牙移动中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验分组和动物模型的建立

选取由中国医科大学附属第二医院实验动物中心提供的日本大耳白兔24只，体重为（2.0±0.2）kg，雌雄不限。所有实验动物均定时、定量摄食，自由饮水。实验动物上颌右侧戴矫治器进行加力，作为实验侧；上颌左侧未戴矫治器，作为对照侧。喂养1周后，2%戊巴比妥钠经耳缘静脉麻醉（2mL·kg-1），使用牙科细金刚砂车针在实验动物右侧上颌第一磨牙和左、右侧上颌切牙牙颈部磨沟，深约0.5mm，然后将左、右上颌切牙连扎，并在其与右侧上颌第一磨牙间放置镍钛螺簧，以左、右侧上颌切牙为支抗，牵引右侧上颌第一磨牙向近中移动，力值为0.784N。在戴矫治器3、5、7、14 d后，经耳缘静脉注入空气，肺栓塞处死实验动物，每次6只。取牙周组织进行实验。

1.2 总RNA的提取及质量控制

依据RNA提取液和试剂盒说明提取冻结组织总RNA，去除骨胶原等杂质，在260 nm和280 nm波长紫外光下测定光密度值（A值），计算A260nm/A280nm值，测得纯度为1.8±0.3。逆转录按实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative-polymerase chain reaction，RQ-PCR）试剂盒说明进行。

1.3 引物设计

PI3K引物序列：上游5’-GCCCAGGCTTACTACAGAC-3’；下游5’-AAGTAGGGAGGCATCTCG-3’，扩增片段长度为236bp。AKt引物序列：上游5’-CTCATTCCAGACCCACGAC-3’；下游5’-ACAGCCCGAAGTCCGTTA-3’，扩增片段长度为242 bp。β-actin为参照，引物序列：上游5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3’；下游5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’，扩增片段长度为318 bp。

1.4 RQ-PCR产物检测

采用荧光染料（SYBR Green）标记的RQ-PCR法检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）mRNA的表达，以β-actin作为内对照，按逆转录试剂盒使用说明进行操作，选用olign（dT）作引物合成第一链cDNA，RQ-PCR检测正畸力作用下PI3K和AKt在牙周组织中的表达变化。所有的逆转录产物在ABI Prism 7500HT序列检测系统中运行。3次独立样本经过3次独立实验后得到的数据用公式RQ=2-△△Ct进行分析。

1.5 Western blot免疫印迹

将组织块剪碎，悬于500μL冰冷缓冲液A（含有20mmol·L-1Triso-HCl、pH值为7.5的0.1 mmol·L-1Na3VO4、25mmol·L-1NaF、2mmol·L-1乙二胺四乙酸、2mmol·L-1乙二醇二乙醚二胺四乙酸、1mmol·L-1DDT、1mmol·L-1苯甲基磺酰氟、2μg·mL-1胰蛋白酶抑制剂、1mmol·L-1亮抑蛋白酶肽）中，冰浴中将组织匀浆粉碎，4℃下18 000 r·min-1离心30min，吸取上清，弃沉淀，考马斯亮蓝法测定样品中蛋白浓度。上清用10%SDS-PAGE分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上，经2h 50V的转印后TTBS洗膜3次，每次5min。用含5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的TTBS封闭，4℃过夜，再与抗PI3K、AKt抗体室温孵育2 h，与相应的HRp标记的羊抗兔二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，超敏化学发光试剂系统显影。采用SPSS12.0统计分析软件对数据进行分析，配对t检验分析Western blot结果。

2 结果

2.1 RQ-PCR结果

正畸施力3 d后，PI3K、AKtmRNA表达开始增强，7 d出现高峰，14 d呈下降趋势（图1、2）。其中7 d时，实验侧与对照侧PI3KmRNA灰度值比为4.04∶1，实验侧与对照侧AKtmRNA灰度值比为4.35∶1，实验侧与对照侧PI3K、AKt相比差异有统计学意义（P＜0.01）。在3、5、7、14 d，实验侧与对照侧PI3K、AKt相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图1 RQ-PCR检测PI3KmRNA在牙周组织中的表达Fig 1 Expression of the PI3K mRNA in the periodontal tissue by RQ-PCR

图2 RQ-PCR检测AKtmRNA在牙周组织中的表达Fig 2 Expression of the AKtmRNA in the periodontal tissue by RQ-PCR

2.2 Western blot免疫印迹结果

施力牙周组织中PI3K、AKt蛋白表达量明显高于对照侧，尤其第7天时，随后又呈下降趋势（图3、4）。经灰度值分析（图5、6）：施力7 d时，实验侧PI3K、AKt的表达量分别为对照侧的3.51、5.42倍。3、5、7、 14 d时，实验侧PI3K、AKt与对照侧比较差异均有统计学意义（P<0.05），其中第7天差异显著（P<0.01）。

图3 PI3K的Western blot免疫印迹结果Fig 3 Results of Western blot analysis of PI3K

图4 AKt的Western blot免疫印迹结果Fig 4 Results of Western blot analysis of AKt

图5 PI3K的Western blot免疫印迹结果的灰度值分析Fig 5 Grey scale analysis of Western blot determined the expression of PI3K

图6 AKt的Western blot免疫印迹结果的灰度值分析Fig 6 Grey scale analysis of Western blot determined the expression of AKt

3 讨论

牙颌畸形的矫治必须对错位的牙、牙弓或颌骨施加一定的矫治力，以引起牙周组织、颌骨在生理限度内的组织改建，这样才能使牙移动，恢复或重建咬合平衡，从而使牙颌系统获得理想的外形，发挥正常的功能，达到矫治畸形的目的[3]。骨的生长与代谢直接或间接的影响正畸疗效，因此，必须深入研究正畸力作用下牙移动的分子机制，寻求更有效的方法，缩短疗程，减轻患者的负担。

mTOR作为一种重要的调节基因，通过调节细胞周期、蛋白质合成、细胞能量代谢等多种途径发挥重要的生理功能，在细胞的增殖、生长、分化过程中起着中心调控点的作用[4-6]。笔者围绕mTOR的上下游做了大量工作。在前期研究中，检测到正畸牙移动时，在兔牙周组织中mTOR及其下游底物p70 S6K的表达明显增强，提示mTOR和p70 S6K参与牙周组织改建，并在牙周组织改建中起作用[7-8]。

mTOR通过PI3K/AKt/mTOR信号通路调控细胞的生长和增殖。AKt可直接磷酸化mTOR的Ser2448位点，激活mTOR和它的下游途径，控制着细胞增殖和转化所需特殊蛋白质的翻译。PI3K/AKt信号途径现被认为是真核细胞生长和增殖的关键信号途径[9]。PI3K/ AKt/mTOR信号通路调控细胞的生长与增殖。成骨细胞的前体细胞即间充质干细胞主要存在于骨骼系统中，在一定的条件下可以通过核心结合因子基因的激活诱导成骨分化。应用雷帕霉素阻断该通路在成骨细胞中的活化，观察到成骨细胞的分化明显受到了抑制。表现在钙质沉积的茜西红染色减弱，显示成骨细胞分化能力明显下降[10]。表明PI3K/AKt/mTOR信号通路的活化在成骨前体细胞的分化过程中起作用。

本实验检测了mTOR的一条主要上游通路PI3K/ AKt的表达。结果表明PI3K、AKt在正畸施力3 d后表达增强，7 d达高峰，而14 d后有下降趋势，推测：正畸力激活成骨细胞，成骨细胞自身产生激肽和生长因子，正反馈激活自身活化，通过生长因子调控PI3K/ AKt/mTOR信号通路，最终影响成纤维细胞、成骨细胞及破骨细胞蛋白的合成、转录过程，产生一系列的生物效应，最终引发正畸牙齿移动。正畸牙移动依赖于牙槽骨的改建，这一改建过程存在一个多因素的调控体系。PI3K、AKt在矫治力作用下的牙周组织改建过程中表达明显增强，证明PI3K、AKt参与正畸牙齿移动过程中的牙周组织改建。改建过程需要合成更多的蛋白，PI3K、AKt的表达增强就是为大量合成蛋白质打基础。关于PI3K/AKt信号通路与正畸力作用下牙周组织改建关系的研究，将会进一步提示正畸力作用下牙周组织改建的发生机制，并为临床加速正畸牙移动提供有效的理论依据。

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（本文编辑 胡兴戎）

The relationship between phosphatidylinositol-3-kinases/protein-serine-threonine kinase signaling pathway and orthodontic tooth movement

LIU Yi,WANG Yan,SUN Su-fen.（Fengtian Dental Clinic,School of Stomatology,China Medical University,Shenyang110013，China）

ObjectiveTo study the relationship between phosphatidylinositol-3-kinases（PI3K）/protein-serine-threonine kinase（AKt）signaling pathway and orthodontic tooth movement.MethodsTwenty-four rabbits were chosen to establish rabbit models for the study.The right maxillary teeth of each animal treated by orthodontics were as the test side, and the untreated left teeth were as the control side.The animals were sacrificed at 3,5,7,14 d,respectively.The prepared tissue specimens were processed for the study.The changes of the expression of PI3K,AKt in periodontal tissues were detected by real-time quantitative-polymerase chain reaction（RQ-PCR）and Western blot techniques.Results RQ-PCR showed that the expression of PI3K,AKtmRNA dramatically changed at 3 d.The expression of PI3K,AKt mRNA in the test side was higher than the control side,especially at 7 d,and then decreased.Compared with the control side,there was statistical significant difference in the test side（P＜0.05）.The study obtained consistent conclusion from Western blot and RQ-PCR.ConclusionExpression of PI3K,AKt in rabbit periodontal tissues increase during orthodontic tooth movement,which prompts that PI3K/AKt signal pathways relate to orthodontic tooth movement and PI3K/AKt signal pathway involve in the periodontal tissue remodeling.

phosphatidylinositol-3-kinases； protein-serine-threonine kinase； real-time quantitative-polymerase chain reaction

R 783.5

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.006

1000－1182（2011）03－0246-03

2010-05-21；

2011-04-05

辽宁省科学技术计划基金资助项目（2009225010-27）；沈阳市科学技术计划基金资助项目（1072033-1-00）

刘奕（1964—），女，辽宁人，教授，博士

刘奕，Tel：024-31973999