平阳霉素-活性炭纳米微粒行口腔癌淋巴化疗的靶向性评价

孙明磊 谢卫红 王昌美 温玉明

（1.郑州大学第一附属医院 口腔颌面外科，郑州 450052；2.四川大学华西口腔医院 头颈肿瘤外科，成都 610041）

平阳霉素-活性炭纳米微粒行口腔癌淋巴化疗的靶向性评价

孙明磊1谢卫红1王昌美2温玉明2

（1.郑州大学第一附属医院 口腔颌面外科，郑州 450052；2.四川大学华西口腔医院 头颈肿瘤外科，成都 610041）

目的 观察平阳霉素-活性炭纳米微粒（PYM-CH-NP）经鼠癌周黏膜下给药后，活性药物在体内各组织器官中的分布情况，探讨PYM-CH-NP对淋巴结转移灶的靶向性。方法 采用改良氯胺T法将125I标记平阳霉素（PYM），应用淋巴结高转移癌株U14建立昆明小鼠颈淋巴结转移模型。将360只颈淋巴结转移模型小鼠随机分为PYM-CH-NP组、PYM组和阴性对照组，分别于癌周黏膜下注射PYM-CH-NP、PYM水溶液和空白活性炭纳米微粒，给药后0.5、1、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168 h处死动物，取血、心、肝、脾、肺、肾和颈淋巴结，检测各时间点各组织器官内平阳霉素的放射活性，计算各样本单位重量的药物放射活性（比放射活性），并计算药物的选择性指数（SI）和靶向指数（TI）。结果 PYM-CH-NP组各时间点颈淋巴结内药物浓度显著高于PYM组（P＜0.001），4 h后血、心、肝、脾、肺、肾等器官中药物浓度均低于PYM组（P＜0.001）。PYM组各时间点的SI均小于1，而PYM-CH-NP组SI和TI最低值为1.793和1.562，最高为72 h时的68.126和14.623。结论 PYM-CH-NP可显著增加淋巴结转移灶内的药物浓度，同时非靶器官药物分布减少，降低了药物的全身毒副反应。

活性炭； 纳米微粒； 平阳霉素； 淋巴结转移； 靶向治疗

癌细胞的扩散和转移是导致癌症患者死亡的主要原因，由于口腔颌面部淋巴循环丰富，口腔癌易早期发生颈淋巴结转移，成为影响患者预后的重要因素之一，因此丰富和提高颈淋巴结转移的治疗手段成为提高患者生存率的重要措施。前期研究中，本课题组经体外实验证实平阳霉素-活性炭纳米微粒（pingyangmycin-activated carbon nanoparticles，PYM-CHNP）保留了平阳霉素（pingyangmycin，PYM）的抗癌活性并具有缓释性[1]。在此基础上，本研究通过建立颈淋巴结转移动物模型，探讨PYM-CH-NP经癌周黏膜下注射后对颈淋巴结的靶向性。

1 材料和方法

1.1 药品、试剂、细胞系及动物

平阳霉素标准品（99.5%，中国食品药品检定研究院），注射用盐酸平阳霉素（哈尔滨博莱制药有限公司，批号03080201），PYM-CH-NP（平均粒径178 nm，PYM与CH-NP按1∶10质量比吸附，四川大学口腔疾病研究国家重点实验室制备）。标记用放射性同位素125I-NaI（放射性浓度为388mCi·mL-1，NEN Life Science Products公司，美国）。氯胺T（分析纯，化学纯度98%，上海松江余山化工厂），偏重亚硫酸钠（分析纯，上海试剂四厂），碘化钾（分析纯，广州化学试剂厂）。Sephadex G-15层析柱（Pharmacia公司，美国）。小鼠宫颈癌淋巴结高转移癌株U14（四川大学华西医学中心免疫学教研室提供）。昆明小鼠360只，雌雄各半，鼠龄6～8周，重22～25 g（四川大学华西医学中心动物实验中心提供）。

1.2 实验仪器

BSZ-160自动部分收集器（上海沪西仪器厂），FH 463-A自动定标器（北京核仪器厂），XH-6010γ放射免疫计数器（西安核仪器厂），旋涡混合器（江苏海门其林医用仪器厂），Sartorious-1712型电子天平（赛多利斯公司，德国）。

1.3 实验方法

1.3.1125I标记平阳霉素 采用改良氯胺T法标记平阳霉素。将平阳霉素标准品1mg、125I-NaI 3mCi、氯胺T 1mg混合，室温振摇150 s后立即上层析柱分离，用淋洗缓冲液淋洗，速度为0.5mL·min-1，收集样品，检测放射活性，制备淋洗曲线，检测125I-PYM的峰值，纸层析法计算该标记物的放射化学纯度和标记率。

1.3.2 颈淋巴结转移动物模型的建立 用小鼠宫颈癌淋巴结高转移癌株U14悬液（5×109·L-1）行昆明小鼠双侧颊黏膜下注射，每侧0.1mL，建立颈淋巴结转移动物模型。

1.3.3 实验分组 将360只颈淋巴结转移模型小鼠随机分为3组：PYM-CH-NP组、PYM组和阴性对照组，每组120只小鼠。PYM-CH-NP组小鼠用PYM-CH-NP按含PYM 10mg·kg-1的剂量（含标记PYM 5μCi）行癌周黏膜下注射，PYM组用PYM水溶液10mg·kg-1（含标记PYM 5μCi）行小鼠癌周黏膜下注射，阴性对照组癌周注射等量的空白活性炭纳米微粒。然后再将每组各平分为12个小组（每小组10只小鼠），分别于注药后0.5、1、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168 h断颈处死小鼠，摘眼球取血，解剖留取心、肝、脾、肺、肾和颈部淋巴结。

1.3.4 小鼠血及各器官中药物放射活性的测定 将小鼠血液盛入肝素化的试管内，计量、称重，将心、肝、脾、肺、肾和颈部淋巴结用生理盐水冲洗后，滤纸吸干水分称重，编号，用γ放射免疫计数器测量放射活性（cpm），计算各样本单位重量的药物放射活性，即比放射活性（cpm·mg-1），该数值代表样本单位重量中平阳霉素的剂量，代表药物浓度。

1.3.5计算PYM和PYM-CH-NP的选择性指数和PYMCH-NP的靶向指数 根据各时间点在血和淋巴结中的药物含量，依据选择性指数（selectivity index，SI）和靶向指数（targeting index，TI）来考察PYM-CH-NP的淋巴靶向性。SI=淋巴结中的药物比放射活性/血中的药物比放射活性；TI=PYM-CH-NP组淋巴结的药物比放射活性/PYM组淋巴结的药物比放射活性。

2 结果

2.1 125 I-PYM的标记率和放射化学纯度

采用改良氯胺T法标记平阳霉素，制备淋洗曲线，共有2个放射峰，第1个峰为125I-PYM，第2个峰为125I-NaI（图1）。纸层析法测得125I-PYM的放射化学纯度为96.3%。经计算，标记率为65%～82%。

图1 125 I标记平阳霉素的淋洗曲线Fig 1 Elution curve of pingyangmycin radiolabeled with 125 I

2.2 小鼠癌周黏膜下注药后各时间点体内血和各器官中平阳霉素的比放射活性

小鼠癌周黏膜下注药后各时间点体内血和各器官中平阳霉素的比放射活性见表1、2。从表1、2中可知：1）PYM组各时间点血中及其他器官内均有较高的药物浓度，淋巴结内药物浓度低于血和肾脏中药物浓度（P＜0.05），高于心脏中的药物浓度（P＜0.05），48 h后高于脾、肺中的药物浓度（P＜0.001）；PYMCH-NP组各时间点颈淋巴结内药物浓度均显著高于血和其他器官内的药物浓度（P＜0.001），持续至168 h颈淋巴结内仍有较高的药物浓度，而血和其他器官内的药物浓度在4 h后已降至很低。2）PYM-CH-NP组各时间点颈淋巴结内药物浓度显著高于PYM组（P＜0.001），尤其表现在12 h后，PYM-CH-NP组颈淋巴结内药物浓度远远高于PYM组，而PYM组注药12 h后颈淋巴结内药物浓度明显趋于降低；PYM-CH-NP组4 h后各时间点血、心、肝、脾、肺、肾等器官中药物浓度均低于PYM组（P＜0.001）。阴性对照组未检测到药物浓度。

表1 小鼠癌周黏膜下注射PYM各时间点血及各器官中平阳霉素的比放射活性Tab 1 Specific radioactivity of pingyangm ycin in plasma and organs of the m ice after submucosa ad jacent cancer injection of pingyangmycin water solution cpm·mg-1

表2 小鼠癌周黏膜下注射PYM-CH-NP各时间点血及各器官中平阳霉素的比放射活性Tab 2 Specific radioactivity of pingyangm ycin in plasma and organs of the m ice after submucosa ad jacent cancer injection of PYM-CH-NP cpm·mg-1

2.3 靶向性分析

根据表1、2计算出PYM-CH-NP和PYM组注射后各时间点颈淋巴结转移灶的SI和TI见表3。由表3可见：PYM组注射后各时间点颈淋巴结转移灶的SI均小于1，表明无淋巴靶向性，而PYM-CH-NP组注射后各时间点颈淋巴结转移灶的SI均大于1，TI也大于1，在24～72 h时TI和SI趋于最高，反映出良好的淋巴靶向性。

表3 PYM-CH-NP和PYM注射后各时间点颈淋巴结转移灶的SI和TITab 3 TI and SI values of cervical lymph nodes after submucosa ad jacent cancer injection of PYM-CH-NP and PYMat each time point

3 讨论

近年来，淋巴靶向治疗作为靶向治疗的一个新领域越来越受到重视，将药物通过靶向给药系统输送至淋巴系统，直接发挥有效的治疗作用，可极大提高治疗效果，降低药物的全身不良反应。传统的药物不具备靶向作用，难以有效达到理想的靶向部位，如何将药物导向临床治疗需要达到的靶向部位是提高药物疗效的关键。纳米给药系统（nanoparticles polymer delivery system，NPDs）有望解决这一难题，这类新型给药系统粒径介于10～1 000 nm，具有缓释性、良好稳定性和靶向性等优点，在肿瘤靶向治疗中具有独特的优势和潜在的应用价值[2]。本研究中PYM-CH-NP即为一种具备淋巴靶向的纳米靶向给药系统，有望提高药物在淋巴靶向器官的生物利用度，降低全身不良反应。

靶向给药系统是根据临床需要，通过选用对机体各种组织或病变部位具有亲和力的载体制作载药微粒，使药物能够输送至治疗期望到达的特定部位，以增加药物在靶器官的分布，减少非靶器官的分布，达到提高疗效、减少毒副作用的目的[3]。载体的靶向方式可分为4种。1）被动靶向：载体对靶细胞不具有识别能力，经通常的生理途径到达身体的某一或某些器官；2）主动靶向：载体具有识别能力，不被人体的单核细胞吞噬系统吞噬，能与特定的靶组织、靶细胞结合；3）物理化学靶向：利用温度、磁场、pH等外加因素将载体靶向目标部位；4）牵制靶向：用无药载体或吞噬细胞抑制剂抑制单核细胞吞噬系统后再导入含药载体，提高其靶向性，但因削弱了机体的免疫能力将导致不良后果。与主动靶向相比，被动靶向给药的可能性和潜能一直为人们所低估，但仍具重要价值。因为首先机体绝大部分属非靶部位，减少载药微粒在非靶部位的特异性摄取是提高主动靶向的前提；其次主动靶向系统必须被动透过内皮细胞才可发挥作用，故药物载体的被动转运是发挥后期作用的首要条件。另外主动靶向载体携带药物时，一些被动性因素如交联药物对抗体产生不良理化作用、药物-抗体交联物被非特异性摄取等可能使定位给药难以实现[4]。本研究中，活性炭纳米微粒携载药物平阳霉素，通过黏膜下注射给药，因载药微粒粒径小，通过被动靶向机理进入内皮细胞间隙或通过内皮细胞的吞噬和胞饮作用进入毛细淋巴管，经淋巴引流进入区域淋巴结，结合纳米微粒的缓释作用，可发挥对淋巴结转移灶持续高浓度的治疗作用，为一种良好的被动靶向制剂。

关于纳米微粒靶向性的质量评价目前尚无统一的标准。本研究选用目前较为公认的2个靶向性评价指标[5]，即SI和TI来评价PYM-CH-NP对颈淋巴结转移灶的靶向性。SI是指给予实验动物载药纳米微粒后，靶器官药物浓度与血液中药物浓度之比。TI是指给予实验动物载药纳米微粒和游离药物后，载药纳米微粒靶器官药物浓度与游离药物靶器官药物浓度之比[6]。当TI和SI值大于1时，表明微粒对靶器官具有靶向性，其值越大，靶向性越强。本实验中靶器官为淋巴结，药物浓度采用药物的比放射活性来代表。实验结果显示：PYM-CH-NP各时间点的SI和TI值最低也为1.793和1.562，而72 h时间点上的SI和TI值高达68.126和14.623，该时间点上靶向性最强。采用125I标记药物分子作为示踪，可灵敏地反映药物在体内的吸收、分布、代谢、转运、排泄等动态变化[7]。研究结果发现：各时间点上PYM-CH-NP组在淋巴结内的药物量都明显高于PYM组，在血及其他重要器官中的药物分布都明显低于PYM组，显示了其良好的淋巴靶向性，同时降低了全身毒副作用。

[1] 孙明磊,王昌美,温玉明.平阳霉素-活性炭纳米微粒对口腔鳞癌细胞系Tca8113和BcaCD885细胞体外的杀伤作用[J].华西口腔医学杂志,2010,25（3）：257-260.

SUN Ming-lei,WANG Chang-mei,WEN Yu-ming.Anticancer effects of pingyangmycin-activated carbon nanoparticles against human oral squamous carcinoma Tca8113 and BcaCD885 cell lines in vitro[J].West China J Stomatol,2010,25（3）：257-260.

Lymphatic targeting study of pingyangm ycin-activated carbon nanoparticles treating oral cancer lymph node metastasis

SUN Ming-lei1,XIE Wei-hong1,WANG Chang-mei2,WEN Yu-ming2.（1.Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou450052,China;2.Dept.of Head and Neck Oncology,West China School of Stomatology,Sichuan University,Chengdu610041,China）

ObjectiveTo investigate the drug distribution in tissues of cervical lymph node metastasis mice model after submucosa adjacent cancer injection of pingyangmycin-activated carbon nanoparticles（PYM-CH-NP）and evaluate the lymph targeting effect of PYM-CH-NP.MethodsPingyangmycin（PYM）was radiolabeled with125I by modified the chloramine T method.Cervical lymph node metastasis mice model was established by buccal submucosa inoculation of a high lymph metastasis cell line U14 cancer cell.360 mice models burdened with cervical lymph metastasis were randomly divided into 3 groups.PYM group was treated with PYM water solution,PYM-CH-NP group was treated with PYM-CH-NP.Negative control group was injected with activated carbon nanoparticles.PYM-CH-NP and pingyangmycin water solution were injected in pericancer submucosa of the mice respectively.The radioactivity of drug in blood, heart,liver,spleen,lung,kidney and cervical lymph node were measured after 0.5,1,4,8,12,24,48,72,96,120, 144,168 h administration.The radioactivity of each samples per unit weight were calculated.The selectivity index（SI）and targeting index（TI）of drug were calculated.Results The radioactivity of drug in cervical lymph node of PYMCH-NP group was much higher than PYM group in each time point（P<0.001）,whereas the blood,heart,liver,spleen, lung and kidney uptake of pingyangmycin was greatly decreased in PYM-CH-NP group after 4 h administration（P< 0.001）.The SI value of PYM group at each time point was less than 1.While the minimum SI and TI value of PYMCH-NP was 1.793 and 1.562,the maxlmum value reached to 68.126 and 14.623 after 72 h administration.ConclusionPYM-CH-NP can increase drug dosage in metastasized cervical lymph nodes,and decrease drug dosage of other organs.So better therapeutic outcome and little adverse reaction may be achieved for lymph node metastasis.

activated carbon； nanoparticle； pingyangmycin； lymph node metastasis； targeted therapy

R 739.8

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.008

1000－1182（2011）03－0253-04

2010-09-23；

2010-12-10

卫生部科学研究基金资助项目（98-1-221）

孙明磊（1973—），男，河南人，副主任医师，博士

温玉明，Tel：028-85501488

·临床研究·