钛片表面粗糙度和氧化膜对成骨细胞黏附影响的体外研究

周屹立 丁仲鹃 唐玲

（1.昆明医学院口腔医学院 口腔修复学教研室，昆明 650031；2.昆明市第一人民医院 口腔修复科，昆明 650032）

钛片表面粗糙度和氧化膜对成骨细胞黏附影响的体外研究

周屹立1丁仲鹃1唐玲2

（1.昆明医学院口腔医学院 口腔修复学教研室，昆明 650031；2.昆明市第一人民医院 口腔修复科，昆明 650032）

目的 研究钛片表面粗糙度和氧化膜对成骨细胞黏附的影响，为选择临床种植体的表面处理方法提供依据。方法 250片纯钛钛片分为5组。采用直径分别为108～130μm（S1组）、216～301μm（S2组）、356～411μm（S3组）TiO2砂对钛片表面进行喷砂处理；另外一组钛片采用钛浆喷涂（TPS）技术处理，设为TPS组；最后一组以600目SiC砂纸打磨组作对照（S0组）。分别测定钛片表面的粗糙度和氧化膜结构。在5组钛片表面进行成骨细胞培养，比较各组钛片表面成骨细胞在黏附1、4、12及24 h时的形态及黏附率。结果 S3组钛片表面氧化膜结构完整、连续，其表面的成骨细胞形态优于其他组。黏附1、4 h时，S3组黏附率高于其他各组（P＜0.05）；黏附12、24 h时，S3和TPS组黏附率高于其他各组（P＜0.05）；黏附4、12、24 h时，S1、S2、S3和TPS组黏附率均高于S0组（P＜0.05）。结论 表面粗糙度较高的喷砂表面的粗糙度和氧化膜结构更有利于成骨细胞黏附。

成骨细胞； 粗糙度； 二氧化钛膜； 黏附

细胞黏附于种植材料表面是细胞表面受体与材料表面的相应配体之间产生分子识别后进一步特异性相互作用的过程。钛种植体的表面性质，包括化学组成、粗糙度、表面能及氧化膜厚度，对种植体与生物体间的反应起重要作用[1-3]。种植材料的表面结构可以选择所吸附蛋白的种类、活性和结构穿膜受体蛋白可以调节细胞与材料表面的黏附，它与细胞骨架结构相联系，其中灶性接触发挥了重要作用。灶性接触成分由一些与细胞骨架和细胞外基质相关的大分子构成，它将整合素受体与细胞骨架肌动蛋白联系起来，影响细胞的伸展、形状及行为[4-6]。可见种植材料表面粗糙度和表面成分的变化对细胞形态及早期黏附行为有重要影响[7]。

本研究采用不同粒度TiO2对纯钛片表面进行喷砂处理，获得3种平均粗糙度分别为1.260、2.313、 3.530μm的表面；临床使用效果较为理想的钛浆喷涂（titanium-sprayed plasma，TPS）表面的平均粗糙度可达5.239μm。本实验将经过上述2种处理的表面进行比较，以探索有利于成骨细胞早期伸展和黏附的适宜的表面粗糙度和处理方法。

1 材料和方法

1.1 钛片表面处理及分析

1.1.1 钛片表面处理 本实验所用钛片均为直径15mm、厚度1mm，共250片。钛片采用丙酮脱脂，用质量分数2%氟化胺、质量分数2%氢氟酸和体积分数10%硝酸于55℃处理表面30 s，质量分数2%氢氟酸和体积分数10%硝酸室温下各处理30 s，去离子水清洗。根据不同的表面打磨方法将钛片分成5组，每组50片。1）砂纸打磨组（S0组）：依次以240、320、600目SiC防水砂纸同方向逐级打磨，至表面呈金属光泽、划痕均匀一致为止。2）喷砂组：分别以直径108～130μm（S1组）、216～301μm（S2组）、356～411μm（S3组）TiO2砂在压力为6.5 kPa、距离为10 cm的条件下垂直对已经砂纸打磨的钛片表面进行喷砂处理，至表面呈均匀的灰色。喷砂仪为JG-5832型，由天津市精工医疗设备技术有限公司生产。3）TPS组：钛片表面与临床常用ITI钛浆喷涂种植体表面相同，由美国Strauman公司提供。S0、S1、S2和S3组钛片表面处理后，用体积分数10%盐酸处理1min，去离子水清洗，体积分数30%硝酸钝化30min后以质量分数5%碳酸氢钠中和，体积分数75%乙醇超声清洗10min，去离子水清洗5min，共2遍。最后去离子水超声清洗10min，共2遍。5组钛片经处理后，均进行高温高压消毒，备用。

1.1.2 表面形貌观察 随机抽取5组钛片中各3片，以扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）（XL30ESEM型，Philips公司，荷兰）在20 kV、放大1 000倍情况下观察各组钛片的表面形貌。

1.1.3 表面粗糙度测量 取经过表面形貌观察的3片钛片，用表面轮廓测量仪（Surfcom-130A型，Seimitsu公司，日本）测量其表面粗糙度。

1.1.4 表面氧化膜检测 随机抽取5组钛片中的各3片，丙烯酸树脂垂直包埋，打磨、抛光，使磨光面暴露出钛片横断面，且钛片垂直于磨光面。表面喷碳，用电子探针分析仪（EPMA-1600型，Shimadzu公司，日本）随机选点，观察并分析氧化膜的厚度和结构。

1.2 成骨细胞的体外培养

取临产SD孕鼠1只（昆明医学院动物科提供），取胎鼠颅顶骨进行常规成骨细胞的培养。

1.3 钛片表面成骨细胞形态学观察

将培养至第4代的成骨细胞，调整为细胞密度为每毫升4×104个的细胞悬液，分别取500μL接种于放有5组钛片的24孔培养板内，每样本设3复孔，分别培养1、4、12、24 h，共60个孔。分别于培养后1、4、12、24 h吸去培养液，加入4℃预冷的质量分数2.5%戊二醛溶液固定，4℃保存。观察时先用梯度乙醇脱水，真空干燥后镀金，然后将钛片中心置于SEM视野的中央，再向固定方向移动视野，观察成骨细胞在不同钛片表面的黏附形态。每个钛片在放大5 000倍的情况下拍摄不同位置的成骨细胞照片2张，每个时间点30张，共120张。随机抽取各时间点的每组钛片成骨细胞照片1张进行分析。

1.4 钛片表面成骨细胞黏附率测定

采用MTT法对不同钛片表面的成骨细胞黏附率进行检测。按上述方法取500μL细胞悬液分别接种于放有5组钛片的24孔培养板内，每样本设8复孔，分别培养1、4、12、24 h，共160个孔。分别于培养后1、4、12、24 h吸去培养液并用PBS洗3次，去除未贴壁细胞，然后加入无血清的DMEM 500μL及5mg·mL-1MTT 50μL，37℃孵箱孵育4 h，加三联液（质量分数10%十二烷基硫代硫酸钠25 g、5%异丁醇12.5mL、0.012mol·L-1盐酸0.3mL，加三蒸水补足250mL）500μL，37℃孵箱内孵育12 h，使结晶物充分溶解。吸取各孔液体200μL至96孔培养板，在酶标板自动读数仪（BL340型，Biotech公司，美国）上以570 nm波长测定各孔吸光度值（A值）。

1.5 统计学分析

选用SPSS 12.0统计软件包进行分析，统计方法采用单因素方差分析，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 钛片表面处理

2.1.1 肉眼观察 砂纸打磨组（S0组）表面呈银白色金属光泽，表面划痕均匀一致；喷砂组（S1、S2和S3组）表面呈深灰色，无金属光泽，表面粗糙程度随喷砂粒度增加而增大；TPS组表面呈浅灰色，粗糙程度最大。

2.1.2 SEM观察 S0组表面可见方向一致的划痕，偶见裂隙和点状凹陷；喷砂组表面呈不规则的多级孔洞，呈蜂窝状，边缘锐利，表面颜色形态均匀一致；S2、S3、TPS组表面存在大量微平面；TPS组表面呈不规则的孔洞结构，表面颗粒有互相融合的趋势，表面颜色形态均匀一致。

2.1.3 表面粗糙度 5组钛片的表面平均粗糙度检测结果分别为：S0组为（0.372±0.131）μm，S1组为（1.260±0.063）μm，S2组为（2.313±0.188）μm，S3组为（3.530±0.305）μm，TPS组为（5.239±0.530）μm。

2.1.4 表面氧化膜 S0组表面氧化膜较薄，厚度为0～7μm，密度较低且不连续；S1组表面氧化膜呈锯齿状，不连续，最厚处约7μm；S2组表面氧化膜呈锯齿状，不连续，最厚处约14μm，密度高于S1组；S3组表面氧化膜密度最高，均匀连续，厚度7～10μm；TPS组表面氧化膜密度最低，不均匀，伪孔处氧化程度较高。

2.2 钛片表面成骨细胞黏附的形态学观察

接种于5组钛片表面1 h后，成骨细胞均呈圆形，边缘光滑，形态单一，其中S2、S3组表面成骨细胞的体积较大，其余各组细胞的大小和形态均相似（图1A、B）。接种4 h后，成骨细胞初步伸展；S2、 S3组表面成骨细胞的片足和丝足结构出现，S1组细胞刚刚伸展，尚无此结构；S2、S3组细胞的细胞浆比较丰富；S0组细胞伸展较好，已有定向生长的趋势；TPS组细胞浆丰富，细胞伸展较好（图1C、D）。成骨细胞接种12 h后，各组细胞均充分伸展，S1、S2、S3及TPS组表面成骨细胞呈扁平状，细胞浆丰富（图1E、F）；S0组细胞呈梭形，细胞拉长，细胞长轴与表面沟纹方向一致。接种24 h后，S1、S2、S3及TPS组表面成骨细胞完全伸展，细胞呈扁平状，形态各异（图1G、H）；S2、S3组成骨细胞的片足结构伸入钛片表面孔洞，与钛片表面紧密结合；TPS组表面成骨细胞伸展较好；S0组细胞呈梭形，细胞体狭长，伸展较好，细胞沿着表面沟纹方向生长，细胞浆较少。

2.3 钛片表面成骨细胞黏附率

不同培养时间的各组钛片表面的成骨细胞黏附率（A值）见表1。培养1 h后，S3组的A值高于其他各组（P＜0.05），其他各组的差异均无统计学意义（P＞0.05）；培养4 h后，S3组的A值高于其他各组（P＜0.05），S1和S2组的差异无统计学意义（P＞0.05）；培养12 h后，S3和TPS组的A值的差异无统计学意义，但均高于其他各组（P＜0.05），S1和S2组的差异无统计学意义（P＞0.05）；培养24 h后，S3和TPS组的A值的差异无统计学意义，但均高于其他各组（P＜0.05），S2组的A值高于S1组（P＜0.05）。培养4、12、24 h后，各实验组的A值均高于S0组（P＜0.05）。

表1 5组钛片表面成骨细胞的黏附率Tab 1 Adhesion rate of osteoblasts on five surfaces

3 讨论

Velten等[8]对热处理、阳极氧化法和溶胶-凝胶法制备生成的氧化膜分别进行研究，结果表明：3种处理方法的表面抗腐蚀性都高于未处理表面，而且当氧化膜厚度达100 nm时，三者的抗腐蚀性和离子渗出率等性能无明显差别。也有实验[9]证实：生物材料与组织相互作用的深度只有1 nm，可以认为种植体表面最外层纳米级范围的表面特性对其生物学行为的影响最为显著。种植体表面处理技术一方面可通过增加粗糙度来增大表面与成骨细胞的接触面积；另一方面可通过调节表面与生物大分子的吸附能力来促进细胞的黏附[10]。本研究表明：喷砂组表面随喷砂颗粒直径的增加，表面粗糙度也增加，氧化膜结构也越均匀致密，越利于细胞早期黏附。在本实验中，各喷砂组表面氧化膜厚度远远高于纳米级，可见影响喷砂组钛片成骨细胞生物学行为的主要因素是平均粗糙度。S0组和TPS组钛片未形成明显的氧化膜或氧化膜不连续，研究S0组和TPS组对成骨细胞生物学行为的作用时，应该考虑其表面化学成分与喷砂组不同这个因素。

成骨细胞接种1 h，各组钛片表面的成骨细胞尚未伸展，不同的表面处理尚不足以引起细胞形态发生显著变化。粗糙度较高的喷砂表面成骨细胞体积较大，提示细胞代谢更旺盛，这种表面更利于成骨细胞早期黏附。随黏附时间延长，各组成骨细胞显示出一些生长早期的特征，也提示粗糙度较高的喷砂表面更有利于成骨细胞早期黏附。成骨细胞在TPS组钛片表面伸展也较好，但细胞体与钛片表面结合不如粗糙度较高的喷砂表面紧密，也少见片足结构伸入钛片表面孔洞内，证实喷砂处理表面更利于成骨细胞与其结合。Mustafa等[11]的研究也表明：成骨细胞在光滑表面或非常粗糙的表面黏附和伸展较好，因为表面粗糙度达到一定程度后，会形成一些微小的光滑平面，利于细胞黏附和伸展。本研究经SEM观察，结果显示：S2、S3和TPS组表面有大量微小平面存在。由此可见：光滑表面和较高粗糙度的表面均有利于细胞伸展，但是光滑表面和TPS表面的成骨细胞胞体扁平，细胞浆不如喷砂表面的细胞浆丰富，细胞功能可能不如喷砂组表面的成骨细胞。表面粗糙度较低或氧化膜缺陷，是成骨细胞生物学行为不如S3组喷砂表面的重要因素。

本研究结果表明：培养1 h后，成骨细胞在S0、S1、S2、TPS表面黏附率的差异无统计学意义。Rosa等[12]认为：以上这几种粗糙表面对生物大分子的吸附作用还不足以在短时间内对细胞黏附率产生明显影响。Mustafa等[13-14]发现：表面粗糙度的增加不能影响成骨细胞在钛片表面的早期黏附。上述实验[13-14]所获得的表面粗糙度均不超过2μm。本实验结果显示：粗糙度较低的2组喷砂表面的细胞黏附率较低，该结果支持上述结论。经过1、4、12、24 h培养后，S3组的细胞黏附率最高，此现象表明：喷砂处理表面的粗糙度增加到一定程度时，其表面形态和氧化膜结构更利于成骨细胞黏附。S3组表面细胞黏附率高于TPS组，除了喷砂表面形态更利于细胞黏附外，其氧化物厚度和结构均优于TPS表面也是重要原因。

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（本文编辑 胡兴戎）

Effect of surface roughness and titanium dioxide layers on commercially pure titanium on attachment of osteoblasts

ZHOU Yi-li1,DING Zhong-juan1,TANG Ling2.（1.Dept.of Prosthodontics,College of Stomatology, Kunming Medical University,Kunming650031,China;2.Dept.of Prosthodontics,The First People’s Hospital of Kunming,Kunming650032,China）

ObjectiveTo study the effects of surface roughness and titanium dioxide（TiO2）layers on commercially pure titanium（cp-Ti）substrates on attachment of osteoblastsin vitro.Methods250 pure titanium slices were divided into five groups.Osteoblasts were cultured on five cp-Ti substrates of ground,which blasted with 108-130μm（S1）, 216-301μm（S2）,356-411μm（S3）TiO2particles and titanium-sprayed plasma（TPS）surfaces,surfaces prepared by hand grinding with SiC paper to 600 grits served as control（S0）.Surface average roughness and the TiO2film structure was evaluated.For morphology and attachment measurement,osteoblasts were cultured for 1,4,12 and 24 h, evaluated by scanning electronic microscope（SEM）observation and MTT assay.Results Osteoblasts spread well on the titanium surfaces.Further more,osteoblasts spread more well on S3surfaces.After 1 and 4 h culture,the number of cells on S3surfaces was the highest（P＜0.05）.The number of cells on S3surfaces was the same（P＞0.05）as TPS surfaces and higher than other groups（P＜0.05）after 12 and 24 h.The number of cells of all experimental groups were higher than S0surfaces after 4,12 and 24 h（P＜0.05）.ConclusionIt was concluded that the coarse TiO2particles blasted surface would optimize initial osteoblast responses.

osteoblast； roughness； titanium dioxide layer； attachment

R 783.1

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.004

1000－1182（2011）01－0013-04

2009-12-31；

2010-06-24

周屹立（1972—），男，浙江人，主治医师，硕士

丁仲鹃，Tel：0871-5330099