拟南芥MYBC1转录因子介导A BA调节的种子萌发

柏 锡，翟 红，朱延明

（1.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2.中国科学院东北地理与生态研究所，哈尔滨 150081）

高盐、干旱和低温等逆境严重影响作物生长发育，造成粮食减产，影响我国乃至世界的粮食安全。因此，如何提高作物耐逆性成为亟待解决的重大问题。随着拟南芥测序工作的完成，公共数据库中积累了大量基因序列信息，但90%基因的功能尚未鉴定，这其中蕴含着许多调控植物耐逆的基因资源。生物信息学方法可以有效的从庞大的数据库中挖掘功能基因，生物信息学的有效挖掘加上反向遗传学方法的有力验证可有效获得功能基因。

MYBC1基因是本实验室在前期研究中，通过生物信息学方法发掘得到的渗透胁迫候选基因[1]。MYBC1编码MYB转录因子，植物MYB类转录因子以含有MYB结构域为共同特征。根据所含MYB结构域的数目，植物中的MYB类转录因子可简单分成3个亚类:只含一个MYB结构的R3亚类[2]；含有两个MYB结构域的R2R3亚类，R2R3 MYB蛋白是植物体中最大的家族，据统计仅在拟南芥中就有100多种[3-4]；含有3个MYB结构域R1R2R3亚类，主要参与细胞周期的控制和调节细胞的分化[5-6]。仅含有1个或MYB区域的R3亚类，根据是否具有一种称为端粒盒（TELOBOX）的结构，可以把这类MYB蛋白分成两个小类[2]。第一小类成员都含有端粒盒结构，如IBP1、BPF1和PcMYB1蛋白等；第二小类成员不含有端粒盒结构，如StMYB1、CCA1、LHY和CPC1蛋白等，不具备端粒盒结构的R3亚类MYB转录因子可能作为转录抑制子行使功能[7]。

通过前期研究发现，MYBC1能够负向调节拟南芥的耐冷性，那么MYBC1与干旱、盐及ABA的关系又是什么样的呢？MYBC1编码R3类转录MYB转录因子，至今还未有报道这类转录因子参与了干旱、盐胁迫反应或ABA信号转导途径，因此对这一基因的深入研究十分必要。在我们的前期研究中，分析了MYBC1在拟南芥的叶中的表达模式，在本研究中我们采用Real-time PCR技术，进一步分析了该基因在拟南芥根部，在高盐、干旱、低温及ABA处理时的表达模式，并以该基因拟南芥缺失突变体为试材，分析MYBC1基因与干旱、高盐及ABA的关系。

1 材料与方法

1.1 植物材料

哥伦比亚野生型拟南芥植株（Wild-type Col-0，WT），由本研究室保存。突变体Salk_072083购自拟南芥突变体库NASC（The European Arabidopsis Stock Centre）。登录网站 http://www.arabidopsis.info/，在seach catalogue搜索基因MYBC1（At2g40970）的突变体，选择T-DNA插入到外显子，且X值较高的突变体。

1.2 幼苗培养

拟南芥无菌培养采用表面灭菌，70%酒精表面杀菌3～5 min后，用15%Belach浸泡灭菌10～15 min，无菌水洗4～5次。置于4℃处理4 d以促进发芽，然后采用滤纸床液体培养法进行无菌培养，培养装置如图1所示。

培养基为1/2 MS液体培养基，16 h光照/8 h黑暗的昼夜节律，光照强度为5000～8000 lx。

图1 滤纸床液体培养法培养的拟南芥Fig.1 Liquid culture of Arabidopsis thaliana on filterpapers-bed

1.3 胁迫处理

哥伦比亚野生型拟南芥采用滤纸桥液体无菌培养14 d，选取长势一致的拟南芥幼苗进行胁迫处理。

1.3.1 盐处理

将原有的1/2MS替换成新鲜的含有300 mmol·L-1NaCl的1/2MS培养基，置于原生长环境中。在0.5、3、6 h，分别提取拟南芥的地下部分和地上部分的总RNA。

1.3.2 模拟干旱处理

将拟南芥幼苗取出，滤纸轻轻吸干根部水，称重，置于超净台吹干，待失水达50%，将拟南芥幼苗放回原生长环境中复水，并在复水0.5、3、6 h后，分别提取拟南芥的地下部分和地上部分的总RNA。

1.3.3 4℃冷处理

将三角瓶中的液体培养基用事先4℃预冷的培养基替换，然后将整个装置置于4℃环境中，在0.5、3、6 h，分别提取拟南芥的地下部分和地上部分的总RNA。

1.4 胁迫处理下MYBC1 Real-time RT-PCR表达特性分析

Real-time RT-PCR采用比较CT法（ΔΔCT），以Actin2（At3g18780）为内参基因，以未经处理的样品作为参照因子。经Actin2基因均一化处理后，通过2-ΔΔCT方法计算目标基因表达量变化差异，以经过处理的样本相对于未经处理的样本的倍数来表示。每个样品做3次技术重复，数据取3次重复的平均值，如果有一个数值的偏差比较大则取两个数据的平均值。并进行3次独立的生物学重复，相对表达量为3次生物学重复的平均值。所用引物序列如下:MYBC1-F 5′AAGGCGGGAACGGTAAC 3′与R 5′CTCTAATGGCGGCATCAAG 3′；Actin2-F 5′TTACCCGATGGGCAAGTC 3′与 R 5′GCTCATACGGTCAGCGATAC 3′。

1.5 MYBC1 T-DNA插入突变体的PCR鉴定

采用CTAB法提取突变体的成熟叶片DNA。采用PCR双引物法对变体进行分型，确定T-DNA双插入的纯合体。两对引物序列如下:H primer（由位于插入位点两侧的基因特异性引物组成）F:5′TCACTATCACCGCAGCTAGAAT 3′与 R:5′TTTC ATTAATTTCCGGCAGG 3′；T primer（由位于基因内部的特异引物和位于T-DNA左臂引物组成）F:5′TACCAAAAGATCCACCTCG 3′与 R: 5′TGTTAT TAAGTTGTCTAAGCGTC 3′。

H primer PCR扩增条件如下:

1.6 MYBC1 T-DNA插入突变体的RT-PCR鉴定

采用Tiangen的RNA提取试剂盒RNAprep Plant Kit提取野生型拟南芥（Col-0）与T-DNA插入缺失突变体总RNA，并用DNaseⅠ(TaKaRa)消化去除基因组DNA污染。采用SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase kit（Invitrogen）反转录成 cDNA。以内参基因Actin2为参照，进行半定量RT-PCR分析。引物序列同1.4，扩增条件如下:

MYBC1 PCR扩增条件均为:

Actin2 PCR扩增条件如下:

1.7 拟南芥种子萌发对ABA、盐及甘露醇敏感性试验

拟南芥种子经表面消毒后，于4℃春化2～5 d，在无菌条件下点播到3%蔗糖，pH 5.8，1.2 g·L-1MES，添加 0.6μmol·L-1ABA 或 100 mmol·L-1NaCl或150 mmol·L-1甘露醇的1/2MS培养基上。培养条件为22～23℃，16 h光照/8 h黑暗的昼夜节律，光照强度为5000～8000 lx，培养14 d，观察拟南芥的生长情况，在播种4 d时统计绿色子叶百分率，生长14 d时拍照并统计根长。

2 结果与分析

2.1 MYBC1的表达特性分析

在前期研究中，分析了MYBC1在拟南芥的叶中经冷、干旱、盐及ABA处理时的表达量变化[9]。发现在拟南芥的叶中MYBC1在冷处理时下调表达；在干旱、盐及ABA处理时下调表达（见图2），那么MYBC1在拟南芥的根中的表达特性是怎样的呢？我们搜索公共数据库的芯片结果，发现MYBC1在冷处理时在根与叶中的表达模式不同:在叶中下调表达，但在根中上调表达[8]，MYBC1在根与叶中的表达模式不同，说明它在根与叶中发挥的作用可能也不同。为了更加全面了解MYBC1的表达特性，我们采用Real-time RT-PCR的方法分析了拟南芥根中MYBC1在各种胁迫处理下的表达量变化情况。结果如图2所示，MYBC1在冷处理时上调表达，但在干旱及盐处理时表达量不发生变化，在ABA处理时上调表达。

2.2 MYBC1基因缺失纯合突变体的获得

采用“PCR双引物法”确定T-DNA插入是否纯合，进一步采用RT-PCR分析MYBC1基因在TDNA插入突变体植株中是否被沉默。从NASC购买T-DNA插入的突变体Salk_072083。NASC上提供的GSS序列第一个碱基一般被认为是T-DNA插入的位点，实际插入位点可能在0～300bp的范围内。通过GSS序列与MYBC1基因组序列比对，可知TDNA插入的位点在基因MYBC1内部距离起始密码子747bp处（见图3）。

PCR分型结果如图4、5所示，以基因组DNA为模板用引物T进行PCR扩增时，3、4、6、7、8、14、15、16、18、20、24、25、26 号共 13 株在约750bp的位置出现扩增，表明这13株有TDNA的插入。同时用引物H进行PCR扩增，这13株在673bp位置未出现扩增，说明这13株突变体为T-DNA插入的纯合体，如图5所示。

选取14号进行基因转录水平的鉴定，以野生型拟南芥为阳性对照，以内参基因Actin2为参照因子，进行RT-PCR鉴定。由图6可以看出，基因MYBC1在突变体中没有被转录，说明T-DNA插入到MYBC1后彻底阻断了基因的转录翻译，14号T-DNA插入纯合突变体命名为mybc1，突变体mybc1的种子，用于下一步的表型分析。

图2 低温(4℃)、干旱、盐及ABA处理时基因MYBC1的Real-time RT-PCR转录水平定量分析Fig.2 Evaluation of MYBC1 transcript levels by Real-time RT-PCR analysis under stress conditions of cold,dehydration,salt and ABA in 2-week-old wild-type Col-0 plants

图3 突变体mybc1的T-DNA插入图谱Fig.3 T-DNA insertion in mybc1

图4 突变体分型T引物PCR扩增结果Fig.4 Genotyping analysis with primer T by PCR

图5 突变体分型H引物PCR扩增结果Fig.5 Genotyping analysis with primer H by PCR

图6 半定量RT-PCR分析MYBC1在纯合突变体中的表达Fig.6 Semi RT-PCR analysis of MYBC1 transcription level in mybc1 mutant

2.3 mybc1突变体在种子萌发期表现出对ABA超敏感

为了研究基因MYBC1与ABA之间的关系，我们做了种子萌发对ABA的敏感性试验。由图7可以看出，在不含ABA的1/2MS培养基中突变体与野生型都能正常萌发，且萌发率没有区别。当将突变体与野生型拟南芥的种子播种到含0.6μmol·L-1ABA的1/2MS培养基，mybc1突变体与野生型拟南芥相比，表现出明显的区别。在播种后4 d时，85.5%的野生型拟南芥能够展开叶片，但只有10.9%的突变体能够展开叶片（如图8所示），且野生型的根长要显著长于mybc1突变体（P＜0.001）（如图9所示）。在种子萌发期，mybc1突变体变现出对ABA的更加敏感。但是mybc1突变体与野生型拟南芥的种子在含有100 mmol·L-1NaCl及150 mmol·L-1甘露醇的1/2MS培养基中萌发率及生长状况均未发生显著变化。

图7 ABA处理下野生型与mybc1突变体种子萌发情况Fig.7 Comparison of germination for wild-type and mybc1 seeds when treated with ABA

图8 ABA处理下野生型与mybc1突变体种子萌发后绿色子叶百分率Fig.8 Green cotyledon rates of wild-type and mybc1 seeds when treated with ABA at 4 d

图9 ABA处理下野生型与mybc1突变体种子萌发后根长统计Fig.9 Root lengths of wild-type and mybc1 seeds when treated with ABA at 15 d

3 讨论

脱落酸(Abscisic acid，ABA)是一种重要的植物激素，参与植物的很多生理过程，如种子成熟和萌发、根和茎的生长、气孔的运动等。ABA还可以作为信号分子诱导胁迫响应基因的表达从而帮助植物去抵御逆境胁迫[10-11]。在ABA信号转导通路中的基因往往参与了不止一个生物学过程，如ABA信号通路中的核心因子ABI1、ABI2与AtPP2CA等不仅控制了种子的萌发、根的伸长，还控制气孔的运动[12-14]，这说明ABA控制的生理学过程相互交叉。但是ABA控制的生理学过程又是相对独立的，如ABA受体FCA不是种子萌发和气孔关闭所必须的，但在ABA抑制侧根形成中起作用[15]；有些基因超量表达后能使植物种子萌发对ABA更为敏感、使植物抗旱能力有所提高，如 AtMYB44、AHK1、SNAC1[16-18]，但也有一些基因同样使植物种子萌发对ABA更为敏感，但却使植物抗旱能力下降，如ABI1、ABI2、ABO3[19-21]。在前期研究中发现，MYBC1以不依赖于ABA的途径调控了拟南芥的耐冷性[9]，在本研究中发现，MYBC1不参与拟南芥抗盐及抗旱能力的调节，但参与了ABA控制的种子萌发，通过本研究同样证实了ABA控制的生理学过程是相对独立的。

MYBC1编码不具端粒盒结构的R3类MYB蛋白，R3类MYB蛋白是调节植物表皮发育的重要因子，例如CPC与TRY作为负向调节因子参与了表皮细胞的发育[22]。R3类MYB蛋白还被发现参与调节了类黄酮的合成、控制了植物的生物钟及光敏色素[23-24]。但还尚未见报道R3类MYB蛋白参与了ABA信号转导通路。本研究证明了MYBC1基因参与ABA信号传导通路，MYBC1基因特异性调节ABA控制的种子萌发。本研究首次发现了R3类MYB转录因子在ABA信号转导通路起到重要的作用，因此通过本研究拓展了对R3类MYB转录因子的认识。

4 结论

本研究采用反向遗传学的方法研究了MYBC1与干旱、盐及ABA的关系。采用Real-time RT-PCR的方法研究了MYBC1在拟南芥根部的表达特性，发现MYBC1不能被干旱及盐诱导表达，但能被冷及外源ABA诱导表达，这说明MYBC1与冷、ABA的关系最为密切。通过PCR和RT-PCR分析鉴定了MYBC1 T-DNA插入的突变体拟南芥mybc1(SALK_072083)。MYBC1的缺失导致拟南芥的种子萌发对ABA更加敏感，但MYBC1并不参与盐及干旱胁迫反应。本研究首次发现了R3类MYB转录因子在ABA信号转导通路起到重要的作用。

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