SYBR Green I荧光检测痕量宿主DNA

蔺 芳，付瑞敏，皮川真，时 凯，叶 刚，江景玉，陈慧珍

（1.新乡学院生命科学与技术系，河南 新乡 453000；2.河南教育学院人口与生命科学系，郑州 450046；3.邦和药业股份有限公司，郑州 450001）

近年来，灵敏、准确的DNA痕量定量方法在生物学研究及应用领域中发挥着重要的作用。痕量定量方法的灵敏度及准确度均需达到较高的标准。紫外分光光度法是以往使用较多的DNA定量方法，此方法操作简便，成本低，但存在灵敏度低、测样量大等问题。目前，检测外源DNA含量常用的方法是Southern blotting杂交法[1]，此法准确性高、特异性强，但存在费时费力的缺点。而荧光定量法是一种灵敏可靠的DNA定量方法，它将荧光染料与DNA结合，利用荧光分光光度计采集结合后增强的荧光信号，通过DNA标准样品计算得出样品DNA的初始浓度。本研究基于SYBR Green I荧光发光原理，来建立一种痕量DNA快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 样品

狂犬疫苗（宁波荣安生物药业有限公司）。

1.2 主要试剂和仪器

Protein Precipitation solution和DNA Hydration solution（为Puregene Cell and Tissue Kit中的两种成分）（德国Qiagen公司）；DNA检测试剂盒（瑞士Roche公司）；SYBR Green I、Pico Green和 λDNA（100 μg·mL-1）（美 国 Invitrogen 公 司）；糖 原(Glycogen)（碧云天生物技术研究所）；蛋白酶K、RNA酶、三羟甲基氨基甲烷、异丙醇和十二烷基硫酸钠（美国Sigma公司）；EDTA(天津市化学试剂三厂)；无水乙醇（天津市科密欧化学试剂有限公司）。多功能酶标仪Varioskan Flash（美国Thermo公司）；LS-45/55荧光／磷光／发光分光光度计（美国Perkin Elmer公司）；3-18K高速台式离心机（德国赛多利斯公司）；紫外交联仪（新芝科技股份有限公司）；电热恒温水浴箱（上海申贤恒温设备厂）；96孔荧光微量滴定板（美国Costar公司）。

1.3 DNA的抽提

500 μL 样品加入 10 μL SDS，10 μL Tris-HCl和 15 μL蛋白酶 K，55℃孵育 3 h；加入 5 μL RNAase 37 ℃ 孵 育 1 h；加 入 167 μL Protein Precipitation solution剧烈震荡20 s，冰浴10 min，16 000 r·min-1离心 5 min；取 620 μL 上清液加入500 μL 异丙醇和 0.5 μL Glycogen于-80℃放置 2 h，16 000 r·min-1离心 30 min；弃上清，加 500 μL 70%乙醇进行洗涤沉淀，16 000 r·min-1离心10 min；弃去上清，待乙醇挥发尽，用100 μL DNA Hydration solution溶解沉淀，65℃孵育1 h，室温轻微震荡过夜，充分溶解DNA[2]。

1.4 SYBR Green I工作浓度的选择

为了选择合适SYBR Green I工作浓度，我们将SYBR Green I分别稀释为 1∶1 000，1∶10 000 和 1∶100 000来绘制DNA的标准曲线（DNA浓度分别为1 600、 800、 400、 200、 100、 50、 25、 12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.2和0 ng·mL-1）。

1.5 不同缓冲液体系对SYBR Green I荧光定量的影响

采用不同的缓冲液（即TE缓冲液，PBS缓冲液和PBS+0.5 mol·L-1（NH4）2SO4缓冲液）对标准λDNA稀释成标准系列（400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.2 和 0 ng·mL-1），SYBR Green I采用对应的缓冲液稀释10 000倍。2 mL DNA溶液+2 mL SYBR Green I稀释液混合后避光10 min，倒入比色皿中用LS-45/55荧光/磷光/发光分光光度计在激发光为485 nm，发射光为518 nm下测定。每个梯度测两个值。

1.6 SYBR Green I荧光定量

1.6.1 样品稀释

用TE将标准λDNA稀释成标准系列（400、200、 100、 50、 25、 12.5、 6.25、 3.125、 1.56、0.78、0.39、0.2 和 0 ng·mL-1）。荧光染料 SYBR Green I荧光染料用TE缓冲液稀释10 000倍。

1.6.2 荧光数据采集

96孔荧光微量滴定板内分别加100 μL标准和样品稀释液，每孔再加100 μL用TE稀释10 000倍的SYBR Green I混合，避光静止15 min。用多功能酶标仪Varioskan Flash在激发光为485 nm，发射光为518 nm下测值。每个标准和样品做2孔[3-4]。

1.6.3 数据处理

计算每个标准和样品的OD值，即OD=（OD测定1+OD测定2）/2，以标准DNA各浓度的吸光值为横坐标，以相应的浓度为纵坐标作图绘制标准曲线，然后将样品的吸光值在标准曲线上找到相应的y值，则原样品 DNA的浓度（ng·mL-1）=y×稀释倍数/5。

1.7 Southern杂交

按窦志勇等采用的杂交方法处理硝酸纤维素膜[5]，并用点样器点样，待检及已知浓度的DNA对照样品均先用沸水煮10 min变性，迅速冷却，20 μL点样。室温晾干膜，紫外线照射膜5 min，然后进行预杂交→杂交→洗膜→封闭→加抗体→洗膜→显色→终止反应，记录结果。由于采用的500 μL体系抽提样品 DNA，用 100 μL DNA Hydration solution去溶解DNA，在点膜前根据样品DNA进行适当的稀释，点膜用20 μL，故原样品DNA的浓度（ng·mL-1）=膜上直读样品 DNA 浓度×10×稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 不同缓冲液体系对SYBR Green I荧光定量的影响

采用不同缓冲体系对DNA和SYBR Green I进行稀释并测值，绘制标准曲线（见图1），记录读数（见表1）。

从图1可以看出，三种缓冲体系的线性关系比较好，相关系数的平方均达到0.99以上。其中，含 0.5 mol·L-1（NH4）2SO4缓冲体系的线性最好，相关系数的平方达到0.9997。但从表1可以看出含0.5 mol·L-1（NH4）2SO4缓冲体系只能检测DNA浓度高于1.56 ng·mL-1的，它的读数相对于其他缓冲体系值远远偏小；TE缓冲体系能检测到50 pg·mL-1，对于检测痕量DNA很有帮助。

图1 不同缓冲体系下DNA标准曲线Fig.1 Standard curve of DNA in different buffer system

表1 不同缓冲体系下DNA标准系列吸光读数Table 1 Absorbance of DNA standard series in different buffer system

2.2 不同稀释度下SYBR Green I DNA标准曲线

将 SYBR Green I分别稀释为 1∶1 000，1∶10 000和1∶100 000来绘制DNA的标准曲线。从图2中可以看出荧光染料在1∶1 000稀释度时DNA浓度在3.125～1 600 ng·mL-1之间，线性关系较好，相关系数的平方达到0.9991；在1∶10 000稀释度时DNA浓度在1.56～1 600 ng·mL-1之间，线性关系较好，相关系数的平方达到0.9999；而1∶100 000稀释度时DNA浓度在0.78～400 ng·mL-1之间，线性关系较好，相关系数的平方达到0.9991。由此可知，荧光染料在1∶10 000稀释度下其线性范围比1∶1 000稀释度广，这样可以节约成本，效果更好。荧光染料在1∶10 000稀释度时虽然灵敏度高，但线性范围窄，所以我们选择荧光染料1∶10 000的稀释度。

图2 不同稀释度下SYBR Green I DNA标准曲线Fig.2 Standard curve of DNA in different SYBR Green I dilution

2.3 荧光法和Southern blotting杂交法的比较

为了进一步验证建立的痕量DNA测定方法，将4个样品经改进的方法抽提后同时经荧光法和Southern blotting杂交法检测DNA的浓度。在Southern blotting杂交法时我们根据样品DNA的浓度进行稀释后点膜(样品3、4在前点膜稀释10倍)。Southern blotting杂交的结果见图3。

表2为荧光法和Southern blotting法通过换算后各个样品抽提前样品DNA的浓度。由于Southern blotting法是半定量的，不能具体读出DNA含量。从表2可以看出Southern blotting结果和荧光检测结果基本可以相互印证。

表2 荧光法和Southern blotting法的对比Table 2 Comparison of fluorescence assay and Southern blotting

3 讨论

目前，用于双链DNA定量的荧光染料主要有溴化乙啶（EB）、Hoechst33258、Picogreen及SYBR Green I。EB是一种常用的凝胶染色荧光染料，由于其自身有较高的本底荧光，与RNA及单链DNA也有较强的结合能力，因此不适用于特异性双链DNA准确定量研究[6]。Hoechst 33258是一选择性与dsDNA结合的荧光染料，可检测到0.01 ng·μL-1的dsDNA样品[7]，并受蛋白影响较小[8]；但该染料对A-T富含区有较强的选择性[9]，并且受DNA长度的限制(<200 bp)[7]。Picogreen是一种嵌入型荧光染料，可以检测到pg级的dsDNA[10]，由于受ssDNA及蛋白影响较小，可以用于dsDNA的定量[11]，但为了增加方法的灵敏度，定量时需要加入较高浓度的染料[12]，增加了实验成本。SYBR Green I与Picogreen具有相似的化学性质[13]，但比Picogreen具有更好的热稳定性，因此可作为dsDNA定量检测。

4 结论

Southern blotting杂交法只是半定量的方法，而荧光法可以根据DNA的标准曲线准确读出DNA的浓度。荧光法和Southern blotting杂交法相比，更快速，精度更高。荧光法检测只需30 min，而Southern blotting杂交法需要2 d。同时，利用SYBR Green I进行dsDNA定量时，所需染料浓度较低，受pH、定量体积及时间影响较小，因此是一种灵敏、快速、经济的dsDNA定量方法。

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