普洱茶样中“金花”微生物的分离鉴定

马 燕 赵 明 周 玲 袁文侠 刘议聪 董燕梅 周红杰

（云南农业大学普洱茶学院·昆明·650201）

一般认为“发花”是形成茯砖茶独特品质的关键工艺，“发花”的实质是通过控制一定的外界条件，促使微生物优势菌——冠突散囊菌（Eurotium cristatum）的生长繁殖，产生金黄色的闭囊壳，俗称“金花”[1]。散囊菌可能产生纤维素酶等胞外酶催化茶叶化合物的转化，能够改善茶叶的品质，还可增加多种微生物代谢活性产物，丰富茶叶成分，增加保健功能，对茯砖品质形成起着重要作用[2]。

部分普洱茶样品也发现有金黄色的小斑点，类似“金花”（图1）。在市场销售过程中，有的茶商直接认为金黄色的小斑点是与茯砖茶中相同的“金花”，而有的则认为不是金花，甚至可能是黄曲霉，因此需要进一步分离鉴定普洱茶中的这些微生物。本文对一个普洱茶样中疑似“金花”的真菌微生物进行了分离鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验茶样

“金花”普洱茶：普洱茶销售人员送检的普洱紧压茶，样品中有金黄色的小斑点（图1），近似茯砖的“金花”。

发花用茶砖：实验室自制的茶砖。

图1 “金花”普洱茶样品Figure 1 Pu-erh tea w ith“jinhua”

1.1.2 试剂

真菌基因组DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒为上海华舜生物工程公司产品；Ex Taq酶和PCR相关试剂购自大连TaKaRa公司；其余试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 茶样微生物分离

茶样微生物分离按国标食品微生物学检验(GB 4789-2010)的方法进行。

1.2.2 微生物鉴定

菌落形态，霉菌：PDA培养基，三点接种，28℃，培养7d。

显微结构，插片法与粘片法[3]。

1.2.3 分子生物学鉴定

应用真菌基因组DNA提取试剂盒(上海华舜生物工程公司产品)提取DNA，按说明书操作。应用引物 ITS4 （5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）和ITS5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）扩增真菌核糖体RNA基因（即rDNA）的转录间隔区（Internal Transcribed Spacer,ITS）[4]，扩整体系按 Ex Taq 酶说明书进行。扩增程序：95℃，5min；（95℃30s，50℃ 30s，72℃ 30s）×40 个循环；72℃，5min。扩增产物委托上海英俊生物工程技术有限公司测序。将序列提交GenBank数据库，利用BLASTn搜索同源序列，选取序列相近的2个GenBank收录序列，用BioEdit软件分析序列与GenBank收录序列的相似性，鉴定菌株。

1.2.4 茶样发花试验

PDA斜面28℃培养7～14d，至菌株长出孢子，以灭菌蒸馏水洗涤，制备孢子悬液，血球计数板计数，稀释至104个/mL，每块茶砖分别接种5mL菌液，30℃保湿培养，15d观察茶砖是否长出“金花”。

2 结果

2.1 茶样微生物分离

应用国标方法分离茶样中微生物，经平板划线纯化，根据菌落形态的差异共获得4株真菌，分别编号01～04。

2.2 菌株的形态特征

各菌株经PDA平板培养（7d），菌落形态见图2，形态描述见表1；经插片法或粘片法观察，各菌落的显微特征见图3，显微特征描述见表1。

表1 菌株01～04的菌落及显微特征Table 1 The clone andm icroscopicmorphology ofstrain 01～04

图2 菌株的菌落Figure 2 The clone ofstrain 01～04

图3 菌株的显微结构Figure 3 Them icroscopicmorphology ofstrain 01～04

2.3 菌株的分子生物学鉴定

扩增测序得到各菌株的ITS序列，Blastn比对分析，菌株01～04分别鉴定为塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）、伞枝犁头霉 （Lichtheimia corymbifera）、阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）和黑附球菌 （Epicoccum nigrum）（表2）。将序列提交GenBank数据库获得序列登记号分别为：HQ728255～HQ728258。

表2 菌株01～04的Blastn比对结果Table 2 The results of Blastn of strain 01～04

2.4 茶样发花试验

茯砖茶中的“金花”主要是冠突散囊菌（Eurotium cristatum）的金黄色闭囊壳，试验从普洱茶样中分离鉴定出1株阿姆斯特丹散囊菌，推测该菌产生的闭囊壳可能是该普洱茶样中的“金花”。为了验证该推测，进行了普洱茶“发花”试验。试验结果显示，接种阿姆斯特丹散囊菌的普洱茶出现了“金花”，与送检“金花”普洱茶样出现的黄色斑点相同（图4）。

图4 接种阿姆斯特丹散囊菌的普洱茶Figure 4 Pu-erh brick tea inoculated with Eurotium amstelodami.

3 讨论

一般认为冠突散囊菌是茯砖中的优势微生物，同时有些样品存在其他散囊菌。王志刚等[5]从17份茯砖茶样品中分离到冠突散囊菌、间型散囊菌、谢瓦散囊菌、匍匐散囊菌、散囊菌、赤散囊菌和一种散囊菌。散囊菌对茯砖茶的品质风味形成具有重要作用。本实验从一普洱茶样中检出阿姆斯特丹散囊菌，感官审评该茶样发现其茶汤红润、透明，有菌菇汤的滋味，推测阿姆斯特丹散囊菌可能增加了该普洱茶样中某些氨基酸的含量。该“金花”普洱茶中氨基酸等化学成分含量的测定及比较有待进一步研究。本试验证实通过接种该阿姆斯特丹散囊菌可以使普洱茶产生“金花”，为特色普洱茶的生产提供了实验依据。

1 宛晓春.茶叶生物化学[M].北京:中国农业出版社,2003.

2 刘子音,许爱清,李宗军,等.茯砖茶中冠突散囊菌及其代谢产物研究进展[J].茶叶通讯,2010,37(1):23～26.

3 黄秀梨.微生物学实验指导[M].北京:高等教育出版社,1999.

4 N L Glass,G C Donaldson.Development of Primer Sets Designed for Use with the PCR To Amplify Conserved Genes from Filamentous Ascomycetes.Applied And EnvironmentalMicrobiology,1995,61(4):1323～1330

5 王志刚,童哲,程苏云.茯砖茶中散囊菌的种类组成和鉴定[J].茶叶科学,1991,11(2):157～161.