定点突变麻鸡副黏病毒ZH-1株F基因及其鉴定

李红丽，詹丽娥，王彩先，唐 娟，陆冰洋

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西 太原 030032）

麻鸡副黏病毒病是由鸡新城疫病毒引起麻鸡的一种高度接触性传染病。近年来，由于NDV强毒株和变异株的流行，使得传统疫苗已不能控制其流行，构建同源高效低毒的弱毒疫苗株，已成为迫切需要[1-2]。

本试验针对麻鸡副黏病毒F蛋白的特点，定点突变麻鸡副黏病毒ZH-1株F蛋白112，115，117位氨基酸密码子，使突变后的F蛋白的裂解位点具有弱毒株的特点[3]，旨在为下一步通过反向遗传技术构建麻鸡副黏病毒ZH-1株弱毒株奠定基础。

1 材料和方法

1.1 质粒、受体菌

工程菌DH5α由山西省农业科学院畜牧兽医研究所预防兽医研究室保存，重组质粒pGF（麻鸡副黏病毒ZH-1株F gene）由该研究室构建。

1.2 酶与试剂

DNA Markers，LATaq酶，限制性核酸内切酶（EcoRⅠ，HindⅢ）购自TaKaRa公司；DNA gel extraction Kit购自vitagene公司。

1.3 PCR引物的设计与合成

根据麻鸡副黏病毒ZH-1株F基因序列[4]，采用PCR体外定点突变技术[5-7]，首先设计1对外侧引物F1和F4，该对引物分别与模板DNA的5′末端、3′末端互补。然后再在突变处设计1对完全互补的引物F2和F3，互补处引物长度为18 bp，设计原则是引物F2和F3有2个互补的、并在相同部位具有相同碱基突变的区域。使用这种重叠PCR定点突变法，需要进行3轮PCR反应。其中，前2轮扩增形成2条有一端可彼此互补的双链DNA片段，二者在其互补区段具有同样的突变，第3轮PCR使这2条片段融合起来，形成完整的目的基因片段。突变引物为:

其中，F1和F4两引物的5′端分别加上了EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点，由斜体表示；F2和F3两引物互补处由下划线标注，突变碱基处由方框标注。

1.4 PCR扩增F变基因[8]

第1，2轮PCR以重组质粒pGF为模板，以引物F1和F2扩增F基因的前351碱基对区域，以引物F3和F4扩增F基因的后1326碱基对区域；第3轮PCR以前2轮PCR纯化回收的产物等量加入作为模板，用引物F1和F4进行扩增，得到裂解位点发生3个氨基酸密码子突变的F变基因。反应体系列于表1和表2。

表1 第1，2轮PCR扩增反应体系

表2 第3轮PCR扩增反应体系

PCR反应条件为:95℃预变性2 min；94℃变性 45 s，58 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 2 min，30 个循环；72℃延伸10 min。将3段PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，并回收纯化。

1.5 F基因克隆、序列测定及分析[9]

将电泳检测正确的目的片段与pGEM-T载体以体积比5∶1进行连接、转化Ecoli DH5α，筛选出阳性克隆株，经酶切、PCR鉴定，目的基因已克隆入pGEM-T载体，阳性克隆菌株送上海生工生物工程公司测序。利用Blast及DNAStar软件分析测序结果。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

将重组质粒pGF分别由引物F1和F2，F3和F4，F1和F4经过第 1，2，3轮 PCR反应后，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，分别得到1条长度为361，1336，1662 bp的基因带，与试验设计结果相符合（图1）。

2.2 重组质粒的酶切鉴定

重组质粒pGEM-F变经EcoRⅠ和HindⅢ酶切后电泳，出现1条长约1.7 kb的基因带和长约3.0 kb的pGEM-T载体带（图2）。

2.3 核苷酸序列及推导的氨基酸序列

酶切鉴定正确的阳性重组质粒经上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，对测序结果进行拼接，得到F变基因的核苷酸序列。扩增的F变基因核苷酸序列长度为1662 bp，编码553个氨基酸。扩增的F变基因112，115，117位氨基酸密码子均被突变，与弱毒株在该处的碱基序列相符，F变基因的其余碱基序列与F基因碱基序列相一致，即

3 讨论

NDV属于副黏病毒科成员，为单股负链分节段RNA病毒，基因组全长达到15186 bp或15192 bp，共编码6种蛋白:核衣壳蛋白（NP）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶（HN）、大蛋白（L）、磷蛋白（P）[10]。F蛋白是禽副黏病毒感染细胞所必需的，它可促进病毒的囊膜与宿主细胞表面的脂蛋白膜融合[11]（又称融合蛋白），使病毒穿入细胞浆脱去核衣壳进行复制。同时，F蛋白也是决定副黏病毒毒力的主要因素[12]。F蛋白首先合成无活性的F0前体形式，F0由蛋白酶水解为F1和一个较小的F2后，才能发挥F蛋白的融合作用。这种裂解取决于病毒毒株和宿主细胞的特性。裂解由宿主含有的蛋白酶完成，强毒株裂解位点两侧具有附加的碱性氨基酸，裂解可以由多种宿主蛋白酶完成，弱毒株裂解位点两侧不含有附加的碱性氨基酸，只能在含有类似胰蛋白酶的部位复制，例如呼吸道和肠道。因此，强毒株的F蛋白能在多种宿主细胞内裂解，使强毒株可在许多组织和器官中复制，对多种细胞具有感染力，导致致命的全身感染，而弱毒株的F蛋白只能在少数特殊类型的细胞中裂解，只对少数细胞具有感染力（临床上表现为局部感染）。

F基因裂解位点区的氨基酸组成是新城疫病毒致病力的分子基础。F蛋白的裂解位点在122位和117位氨基酸之间，强毒株为112Arg-Arg-Gln-Arg/Lys-Arg-Phe117，在Gln两侧各有1对碱性氨基酸，这对F0的有效裂解具有重要作用。弱毒株以中性氨基酸取代了强毒株中的碱性氨基酸，特别是112位和115位碱性氨基酸被取代，F0更不易裂解，它以非活性形式编入子代病毒中，从而丧失了病毒囊膜与宿主细胞表面的脂蛋白膜融合的活性，感染性很低。117位的氨基酸也是影响裂解的主要因素，强毒株为Phe，弱毒株为Leu；Phe虽不是裂解必需的，但转变为Leu时却能抑制裂解。

PCR反应的出现推动了定点突变的发展，以PCR为介导的定点突变技术为基因修饰、改造提供了一条重要途径。通过改变引物中的某些碱基而改变基因序列，达到有目的地改造蛋白质的结构、研究蛋白质的结构和功能之间的关系的目的。重叠PCR延伸法是最经典的PCR介导的定点突变技术[13-14]，该方法利用PCR技术在体外进行有效基因重组和定点突变，且不需要内切酶消化和连接酶处理；该技术使用简便，利用其可快速获得其他依靠内切酶方法难以得到的产物。

麻鸡副黏病毒ZH-1株属于基因Ⅸ型NDV，其F蛋白裂解位点区（112～117 aa）的氨基酸序列为112Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe117，与强毒株在这一区域的序列相符。同时，依据国际上判定新城疫病毒毒力的标准，测定该毒株的鸡胚平均死亡时间（MDT），脑内致病指数（ICPI）和静脉接种致病指数（IVPI）分别为 69.6 h，1.66 和 1.65，鸡胚最小致死量（MLD）为10-7，具有与新城疫病毒速发型相似的毒力，属于强毒株。根据麻鸡副黏病毒ZH-1株F蛋白与传统新城疫弱毒株F蛋白的裂解特点，我们设计了此试验对麻鸡副黏病毒ZH-1株进行F基因定点突变，使表达的F蛋白在裂解位点处氨基酸的组成具有弱毒株裂解位点的特点。由于改变的3个氨基酸并不是影响F蛋白结构的主要因素，因此得到的F变基因编码的蛋白与原F蛋白的抗原表位、疏水性、亲水性以及糖基化几乎完全保持一致。本研究为下一步构建麻鸡副黏病毒ZH-1株弱毒株奠定了基础。

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