酶抑制法快速检测蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留

王洁莲

（山西省农产品质量安全检验监测中心，山西 太原 030001）

民以食为天，食以安为先。蔬菜是人们生活中必不可少的辅助食物之一，其质量安全直接关系着人们的身体健康。有机磷农药是病虫害防治常用药物，在蔬菜上使用就可能有较多的农药残留[1]。而蔬菜中农药残留是衡量蔬菜质量安全的重要指标，其检测技术有很多种，包括生物活体分析法、仪器分析法、酶抑制法等检测手段。比较而言，生物活体分析法只对少数药剂有反应，无法辨别残留农药的种类，准确性较低。仪器分析法检测农药残留是一种定性、定量分析法，分析结果准确，但要求有专业的实验室和技术人员，技术难度高，仪器昂贵，分析样品所需时间长，要想及时掌握蔬菜质量安全是不现实的。而酶抑制法可快速检测蔬菜中的农药残留，方法简单、自动化程度高、成本低、易掌握等。

1 酶抑制法快速检测技术在国内外应用现状[2]

酶抑制快速检测技术对所测样品的前处理要求简单，多数样品可直接用于测试，在我国得到了较快的推广应用。目前，研制成功了100多种农用药物检测试剂盒，其中常见的农药残留检测试剂盒有近30种。美国、加拿大、日本、巴西、印度等10多个国家，已将酶抑制法试剂盒或试纸条作为普查农药残留和田间实地检测的基本手段，许多公司专门从事检测试剂盒或试纸条的开发与应用，几乎所有重要农药品种都有残留检测试剂盒出售。酶抑制法快速检测技术已经成为国内外快速检测农药残留的主流技术，也是现阶段比较合理的选择方案之一。

2 酶抑制法检测技术介绍

2.1 酶抑制法检测原理[3]

有机磷和氨基甲酸酯类农药品种繁多，分子结构各不相同，但它们的作用机理相同，都能抑制昆虫中枢和周围神经系统中的乙酰胆碱酯酶活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导使昆虫中毒死亡。如果蔬菜的提取液中含有有机磷和氨基甲酸酯类农药，则可抑制胆碱酯酶的活性，反之则不然。利用昆虫毒理学反应的这种共性，在酶反应试验中加入底物和显色剂，通过观察颜色的变化或测定酶与某种特定化合物反应的物理化学信号的变化可判断是否存在有机磷或氨基甲酸酯类农药残留。

2.2 酶抑制法检测农药残留的灵敏度与使用的酶、反应时间、温度等有密切关系

无论采用何种检测方法，酶是其中决定检测方法灵敏度和可靠性的最关键因子。酶对常用有机磷和氨基甲酸酯类农药的敏感度决定了方法的灵敏度，酶的种类决定了方法的可靠性。目前，常用于农药残留检测的酶是胆碱酯酶，胆碱酯酶又分为丁酰胆碱酯酶和乙酰胆碱酯酶。胆碱酯酶的来源如表1所示。

表1 胆碱酯酶的来源[4]

3 检测方法

依据酶抑制法原理设计的农药残留检测方法，主要有试纸法、比色法和胆碱酯酶生物传感器法。

3.1 试纸法

将敏感生物（如马、牛等）的胆碱酯酶和乙酰胆碱类似物2，6-二氯靛酚乙酸酯分别经固定化处理后加载到滤纸片上，靛酚乙酸酯在胆碱酯酶催化下迅速发生水解反应，生成蓝色的靛酚和乙酸，如果胆碱酯酶与有机磷或氨基甲酸酯类农药结合，便失去催化靛酚乙酸酯水解的能力，因此，在样品中只要有微量的有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，就能强烈地抑制蓝色产物的生成，靠目测就可判断农药残留情况。即:蓝色表示无农药残留，浅蓝色或白色表示有农药残留。韩承辉等[5]从小麦中提取植物酶制作的试纸，可在5～10 min内检测蔬菜中常用的几种有机磷农药。这些方法对常见农药的检出限大都高于相应农药的最大残留限量，因此，它只能作为定性的快速初筛检测法。该方法不需仪器，操作方便、快速，测试成本低，主要用于口岸、市场等蔬菜现场残留检测。

3.2 酶生物传感器法

酶生物传感器是一种将酶作为生物敏感部件与各种物理化学转换器紧密配合，对特定种类化学物质具有选择性和可逆响应的分析装置[6]。生物敏感部件与特定分析物之间反应会产生一些物理化学信号的变化，再通过转移器转化，放大后显示或记录下来。酶生物传感器是近年来农药残留研究最为活跃的领域。先后用丁酰胆碱酯酶[7]和乙酰胆碱酯酶传感器测量有机磷农药残留，使酶抑制法的检测灵敏度和准确性又有了很大提高，但现阶段胆碱酯酶等生物材料在固定化过程中活性容易失去的问题还没有很好解决，影响了这一技术的推广应用。

3.3 比色法[8]

将蔬菜样品残留提取液与从敏感生物中提取的胆碱酯酶作用，以碘化硫代乙酰胆碱（ATCI）等为底物，二硫代-二硝基苯甲酸（DTNB）等为显色剂，经一定时间反应后，利用农药残留速测仪在410 nm波长下比色，根据吸光值的变化计算胆碱酯酶的抑制率，从而判断有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量是否超标。比色法具有灵敏度高及成本低等明显优势，是目前使用的主要方法。市场上使用的酶主要是从敏感家蝇头部提取纯化的乙酰胆碱酯酶（AChE）和从动物血清中提取的丁酰胆碱酯酶（BuChE），用丁酰胆碱酯酶检测农药残留存在着专一性和可靠性低、检测结果假阳性率高等问题。以敏感家蝇头部提取纯化的乙酰胆碱酯酶为酶源的方法所需时间虽短，操作误差小，但由于乙酰胆碱酯酶主要从家蝇等敏感昆虫头部提取，产量低，成本高，所以，未能广泛推广。

4 酶抑制法检测技术在实际应用中存在的问题

酶抑制法检测技术虽具有方便、快速、成本低等优点，但在使用过程中也存在一些亟待解决的问题。

4.1 酶源的选择[9]

动物体内的酯酶是十分复杂的类群，如乙酰胆碱酯酶（AChE）、丁酰胆碱酯酶（BuChE）等，不同酯酶对农药的反应大不相同。如马血清中丁酰胆碱酯酶对异六甲磷的抑制率比乙酰胆碱酯酶高11300倍，而对丙胺氧磷的抑制率却高达4200倍。在昆虫体内AChE的异构体有10多种，不同异构体对农药反应也千差万别。据研究，苍蝇体内头部、胸部的AChE异构体对农药的反应截然不同，用对氧磷分别点滴头、胸部发现，头部AChE不受抑制，而胸部的AChE则非常敏感。同样，胸部3种不同异构体对马拉硫磷反应也相差好多倍；不同昆虫、不同抗药性种群中的AChE对农药反应更是南辕北辙。因此，敏感酶源的选择与提取是检测准确性的关键，同一批次样品必须选用同一批次酶源。

4.2 酶促条件[10]

酶是一种特异性的蛋白质，酶促反应要求十分严格，温度、酸碱度、氧化还原电位是左右酶促反应的重要条件。另外，酶的固定与贮存、酶的浓度、反应底物剂量、显色剂的选配及稳定等等都会影响测试结果，而这些条件的控制与掌握，不是一般速测环境所能确保的，所以测试结果就难有重现性，也会出现差错。

4.3 某些农产品种类不能检测或有影响

如芹菜、韭菜、洋葱等有刺激味的蔬菜样品含有过多的叶绿素、花青素、植物次生物质，对检测结果有干扰作用，造成检测结果呈假阳性。样品提取液的pH值对胆碱酯酶的活性有影响，如农药速测卡使用的最佳pH值为7.5，若样液的pH值偏离太大就会产生错误的结果。另外，反应过程中的时间、温度等均对检测结果有影响。

4.4 酶抑制法测定农药种类有限[11]

目前，主要用于蔬菜、水果中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留检测的酶抑制法，不能检测其他类型的农药，且不能给出定性和定量结果，最低检出浓度偏高，导致某些农药品种的检测结果出现假阴性，因此，其只能用于市场上对蔬菜的初筛。当检测到有农药残留的蔬菜时，还需用色谱仪器进行定性定量分析，方能作出最终结论。

5 前景与展望

国内外实践证明[12]，酶抑制法快速检测农药残留技术是控制有毒蔬菜产品进入市场和餐桌的有效手段。当前，蔬菜、水果中农药残留检测技术已达到了一定的水平，气相色谱、高效液相色谱、气质联用、液质联用等也有了很大的发展，酶抑制法快速检测农药残留的方法可作为仪器分析方法的有益补充，针对市场、农场蔬菜中农药残留进行快速检测，再用精密的色谱分析法确定阳性或可疑样品，可保证上市蔬菜的安全性，达到全面监控农药残留的目的。

［1］赵卫星，孙治强，陈之群，等.夏萝卜中有机磷农药残留消解动态及影响因素[J].河南农业科学，2004（11）:67-69.

［2］王洁莲.农药残留检测前处理技术的发展 [J].山西农业科学，2008，36（10）:28-29.

［3］刘永杰，张金振，曹明章，等.酶抑制法快速检测农产品农药残留的研究与应用[J].现代农药，2004，2（3）:81-83.

［4］李顺，纪淑娟，孙焕.酶抑制法快速检测蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的研究现状 [J].食品与药品，2008，6（7）:25-28.

［5］韩承辉，王乃岩，王正萍.用植物酯酶片快速测定蔬菜上有机磷农药[J].环境保护，1998（12）:31-32.

［6］王洁莲，张子伦.果蔬中农药残留速测技术的应用与发展[J].山西农业科学，2010，38（1）:91-94.

［7］邹月春，赵李霞.酶抑制法快速检测农产品农药残留的研究与应用[J].生命科学仪器，2006，2（4）:29-32.

［8］高晓辉，朱光艳.蔬菜上农药残毒快速检测技术——酶抑制法检测有机磷和氨基甲酸酯类农药 [J].农药科学与管理，2000，21（4）:29-31.

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［12］孙卫国，阎会平.采用酶抑制法加强对蔬菜农药残留的检测 [J].山西农业，2003（2）:32-33.