局部应用IL－12对小鼠S180实体瘤的抗瘤效应及机制初探

蒋丽娜，杨新玲，刘 华，葛丽平，孙 黎，翟登高

（1．河北北方学院医学检验学院免疫学教研室，河北 张家口075000；2．河北北方学院医学检验学院微生物学教研室，河北 张家口075000；3．河北北方学院生命科学研究中心，河北 张家口075000；4．河北北方学院医学检验学院预防医学教研室，河北 张家口075000）

白细胞介素－12（IL－12）是主要由巨噬细胞等抗原提呈细胞产生的异二聚体细胞因子，是免疫调节网络中的关键调控分子，具有多重抗肿瘤生物活性，不仅对肿瘤有直接的抑制作用，而且可以调节机体免疫系统使其处于有效发挥抗肿瘤作用的细胞免疫应答状态［1］．该研究对小鼠S180实体瘤模型采用IL－12进行免疫治疗，通过T细胞亚群测定、瘤体组织学观察，从细胞免疫的角度分析IL－12抗肿瘤作用的机制．

1 材料与方法

1．1 材 料

1．1．1 主要试剂 DMEM培养基为美国Gibco公司产品．藻红蛋白 （phycoerythrin，PE）标记的大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体、异硫氰酸荧光素 （fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的大鼠抗小鼠CD3单克隆抗体、别藻青蛋白 （APC）标记的大鼠抗小鼠CD8单克隆抗体及鼠源重组IL－12试剂购自深圳晶美生物有限公司，其它试剂均为分析纯．

1．1．2 动物 6～8周龄Ba LB／c系小鼠，18～20 g，雌性，由河北医科大学实验动物中心提供．

1．1．3 细胞株 S180细胞株由河北医科大学实验动物部提供．

1．2 方 法

1．2．1 动物模型的建立 于Ba LB／c小鼠左后肢皮下接种1×107个S180瘤细胞，荷瘤成功后，开始抑瘤实验．

1．2．2 实验分组和给药 将40只荷瘤成功的小鼠随机分为生理盐水 （对照组）和0．5 ng／m L IL－12治疗组，每组为20只．于荷瘤第7、14、21天每只小鼠瘤旁注射生理盐水0．2 m L、0．5 ng／m L IL－12 0．2 m L．

1．2．3 抑瘤率和瘤指数的检测 末次治疗一星期后，各组动物同时全部处死，剥离瘤体称重，计算抑瘤率和瘤指数．

1．2．4 外周血中T淋巴细胞亚群的检测 将各组小鼠摘取的眼球抗凝血采用直接免疫荧光－流式细胞术，测定外周血中CD3＋T、CD4＋T细胞和CD8＋T细胞的百分率，计算CD4＋／CD8＋比值．

1．2．5 形态学检查 将肿瘤组织用10%甲醛进行固定，留作光学显微镜观察形态学并拍照．

1．2．6 观察指标 动物的一般情况及肿瘤生长状况的观察：每日观察小鼠的饮食、毛色、活动等一般状况；开始抑瘤实验的同时，定期 （每隔3天）用游标卡尺测量肿瘤大小，以0．5× （长＋宽）表示［2］；并每日测量记录每只小鼠的体重．

1．3 统计学分析

2 结 果

2．1 小鼠的一般情况观察

自第14日后，生理盐水组小鼠一般状况变差，逐渐出现精神萎靡、行动迟缓、毛发干涩；而同期的IL－12组小鼠一般状况明显优于生理盐水组小鼠，精神一直很好，行动比较敏捷，毛发油亮．

2．2 IL－12对小鼠S180移植肿瘤生长的动态影响

各组小鼠在接种肿瘤细胞第7天左右开始触摸到瘤块，对照组的肿瘤生长速度快．第14天，IL－12组的肿瘤大小达到 （7．56±0．09）mm，此后逐渐缩小，到第27天时，肿瘤大小为 （5．12±1．56）mm，明显小于生理盐水组 （15．34±3．18）mm （P＜0．01）（见图1）．

结果显示，应用IL－12有显著的抗肿瘤效果，肿瘤生长受到明显抑制．实验过程中发现有的小鼠肿瘤局部有明显炎症反应，瘤组织出现坏死，癌肿向下凹陷，最后肿瘤组织变硬、结痂而脱落，甚至出现肿瘤消退现象．

2．3 各组小鼠抑瘤率和瘤指数的比较

IL－12实验组的抑瘤率为 （31．85±7．24）%，见表1．

生理盐水组小鼠瘤指数为 （7．67±0．67），IL－12组的小鼠瘤指数为 （3．95±0．49），明显低于生理盐水组 （P＜0．01）（见表1）．

图1 小鼠S180移植肿瘤生长趋势

表1 各组荷瘤小鼠的瘤指数和抑瘤率的变化比较

2．4 荷瘤小鼠外周血中T细胞亚群的变化

从表2、图 （2、3）可见，不论是生理盐水组还是IL－12组的小鼠外周血中CD3＋、CD4＋、CD8＋T细胞均低于正常小鼠，说明小鼠荷瘤后机体的免疫功能均下降．采用IL－12治疗后，上述指标均高于生理盐水组 （P＜0．05），CD4＋／CD8＋比值也上升，说明通过治疗，荷瘤小鼠的免疫功能得到改善．

表2 荷瘤小鼠和正常小鼠血液中T细胞亚群百分率表达的比较 ±s）

表2 荷瘤小鼠和正常小鼠血液中T细胞亚群百分率表达的比较 ±s）

注：＊与生理盐水组相比P＜0．05

组别 n CD3＋ CD4＋ CD8＋ CD4＋／CD8＋正常小鼠 10 68．00±7．07 45．70±5．50 25．00±2．97 1．82±0．2．73±0．30 18生理盐水组 20 40．86±4．20 28．68±4．13 11．96±1．02 2．41±0．42 IL－12组 20 55．12±6．63＊ 39．65±5．08＊ 14．53±1．73＊

图2 流式细胞仪分析T细胞亚群结果 （对照组）

图3 流式细胞仪分析T细胞亚群结果 （IL－12组）

2．5 肿瘤细胞的形态学观察

2．5．1 生理盐水组小鼠肿瘤细胞形态学观察：肿瘤细胞密集成团，大小不等，核仁大、明显，核内异染色质少，胞质深浅不等 （见图4）．

图4 生理盐水组小鼠肿瘤细胞形态学观察 （HE×400，↑肿瘤细胞）

2．5．2 IL－12组小鼠肿瘤细胞观察：核固缩，细胞碎片多，出现大片坏死，但淋巴细胞和巨噬细胞少见（见图5）．

图5 IL－12组小鼠肿瘤细胞形态学观察 （HE×400，↑细胞坏死）

3 讨 论

在众多刺激对抗肿瘤抗原的有效免疫应答的策略中，用适当的免疫佐剂加强抗原的免疫原性是其中之一．最近，IL－12已被确定为多种传染病疫苗接种模型的强有力佐剂．无论局部或全身给予IL－12或IL－12基因转导细胞疫苗，在动物的肿瘤疫苗研究中均获得可喜成果．以人类为研究对象的实验数据清楚地表明，IL－12能够增强肿瘤特异性细胞反应［3］．

IL－12抗肿瘤效应涉及固有免疫和适应性免疫效应机理．IL－12诱导的IFN－γ和其它二级、三级前炎症细胞因子级联效应对肿瘤细胞有直接毒性作用，或者可以激活有效的抗血管生成机制［4］．在本次研究中，采用鼠源重组IL－12瘤旁皮下注射，观察其对荷瘤小鼠的治疗效果．结果显示，IL－12具有良好的抗肿瘤效果，能诱导荷瘤小鼠体内明显的免疫应答．

Kanagawa等研究表明，在IL－12无效的小鼠Meth－A肿瘤模型局部注射IL－12能够引起对肿瘤细胞的局部和系统免疫应答，并诱导机体免疫应答和改变肿瘤微环境的协调效应，而改变肿瘤微环境可以增强淋巴细胞浸润，导致抗肿瘤效应［5］．本实验结果显示，荷瘤小鼠外周血中CD3＋T、CD4＋T、CD8＋T细胞所占百分比均显著低于正常小鼠 （P＜0．01），说明荷瘤小鼠不论是治疗组还是生理盐水组其机体免疫功能低于正常小鼠．采用IL－12进行免疫治疗后，外周血中CD3＋T、CD4＋T、CD8＋T细胞所占百分比均较生理盐水组有显著提高 （P＜0．05），提示IL－12治疗对恶性肿瘤小鼠体内的细胞免疫能力有恢复作用，使机体的免疫功能有明显的改善．一般认为，CD8＋T细胞在杀伤肿瘤细胞中起主要作用，CD4＋T细胞在肿瘤免疫中起重要的辅助作用，而CD4＋／CD8＋的比值的大小直接反映出机体细胞免疫的功能强弱［6，7］．本实验发现IL－12治疗组的CD4＋／CD8＋的比值高于生理盐水组 （P＜0．01），这提示小鼠的机体可能通过增强细胞免疫功能来实现抗肿瘤的．体内和体外研究揭示，IL－12能够快速改变肿瘤相关巨噬细胞和肿瘤浸润巨噬细胞的功能［8］．本实验发现，生理盐水组的肿瘤组织，肿瘤细胞密集成团，核仁大、明显，大小不一，具有核分裂像；IL－12治疗小鼠的肿瘤组织中可见大片肿瘤细胞坏死，但很少见到炎性细胞，但可见到核固缩、核碎裂和许多细胞碎片，提示IL－12可能通过诱导细胞凋亡来实现抗肿瘤的作用．

本实验结果表明IL－12在体内具有良好的抗肿瘤作用，经其治疗后，细胞免疫方面的指标 （CD3＋T、CD4＋T、CD8＋T、CD4＋／CD8＋）均得到明显改善，提高了细胞免疫功能，因此认为IL－12的抗肿瘤作用主要是通过调节机体免疫功能来实现的．Cao等研究揭示IFN－γ信号转导直接引起Treg细胞周期停滞，IL－12——IFN－γ轴能够抑制肿瘤诱导的Treg细胞增殖，这一机制可以抵消体内Treg细胞促进肿瘤生长的能力［9］．我们课题组将通过进一步检测Treg细胞及血清中IFN－γ、IL－2等深入研究IL－12的抗肿瘤机制．

［1］ Kilinc MO，Aulakh KS，Nair RE，et al．Reversing tumor immune suppression with intratumoral IL－12：Activation of tumor－associated T effector／memory cells，induction of T suppressor apotosis，and infiltration of CD8＋T effedctors［J］．J Immunol，2006，177 （10）：6962－6973

［2］ 张建华，赵德矿，王青青，等．IL－12基因联合CD40L基因治疗小鼠黑色素瘤的实验研究 ［J］．中国免疫学杂志，2007，23 （05）：426－429

［3］ Portielje JE，Gratama JW，van Ojik HH，et al．IL－12：a promising adjuvant for cancer vaccination ［J］．Cancer Immunol Immun，2003，52 （03）：133－44

［4］ Colombo MP，Trinchieri G．Interleukin－12 in anti－tumor immunity and immunotherapy ［J］．Cytokine Growth Factor Rev．2002，13 （02）：155－68

［5］ Kanagawa N，Gao JQ，Motomura Y，et al．Anti－tumor mechanism of intratumoral injection with IL－12－expressing adenoviral vector against IL－12－unresponsive tumor ［J］．Biochem Biophys Res Commun，2008，372 （04）：821－825

［6］ Wang S，Zheng Z，Weng Y，et al．Angiogenesis and anti－angiogenesis activity of Chinese medical herbal extracts ［J］．Life Sci，2004，74 （20）：2467－2478

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［9］ Cao X，Leonard K，Collins LI，et al．Interleukin 12 stimulates IFN－gamma－mediated inhibition of tumor－induced regulatory T－cell proliferation and enhances tumor clearance ［J］．Cancer Res，2009，69 （22）：8700－8709