通乳散癖汤对乳腺增生病模型大鼠乳腺组织Bcl-2、PCNA表达的影响*

李朝平，路艳清

（1.甘肃中医学院妇产科教研室，兰州 730000；2.甘肃省平凉高等医学专科学校，平凉 744000）

通乳散癖汤对乳腺增生病模型大鼠乳腺组织Bcl-2、PCNA表达的影响*

李朝平1，路艳清2

（1.甘肃中医学院妇产科教研室，兰州 730000；2.甘肃省平凉高等医学专科学校，平凉 744000）

[目的]检测抗凋亡基因（Bcl-2）、增殖细胞核抗原（PCNA）基因表达与乳腺增生病组织学的相关性，通过乳腺增生病癌变趋势的生物学指标研究探讨通乳散癖汤对乳腺增生病的干预治疗作用。[方法]采用苯甲酸雌二醇联合黄体酮腹腔注射诱导建立乳腺增生病大鼠模型，分别用通乳散癖汤高、中、低剂量和对照药乳癖消灌胃治疗。免疫组化检测各组大鼠乳腺组织标本中Bcl-2、PCNA的表达情况。[结果]通乳散癖汤能够调整实验大鼠乳腺组织Bcl-2、PCNA的表达水平。[结论]通乳散癖汤可能是通过抑制细胞增殖，诱导凋亡，从而实现抑制乳腺增生的作用。

通乳散癖汤；乳腺增生病；大鼠

现代医学治疗本病目前尚无特效疗法，中医学在中医基础理论指导下依据辨证论治原则临床治疗本病取得了满意效果。通乳散癖汤经临床验证具有良好效果，但其机制、环节、最佳用药剂量及对乳腺增生病干预治疗作用等尚不清楚，为此设计了本实验。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 成年健康未孕Wistar雌性大鼠（兰州大学医学动物实验中心提供）60只,体质量150～180 g，适应性饲养1周后开始实验。

1.1.2 实验药品与试剂

1.1.2.1 中药及中成药 通乳散癖汤是李朝平教授在临床应用多年的经验方，经反复验证，能有效消除乳房疼痛、肿块、溢乳等乳腺增生病的症状、体征，临床效果显著。其组方（仙茅、仙灵脾、鹿角霜、郁金、柴胡、浙贝母、川楝子、山慈菇各10 g，夏枯草、王不留行各15 g，天门冬20 g）；乳癖消片（辽宁好护士药业有限责任公司生产）。

1.1.2.2 西药 苯甲酸雌二醇 (天津金耀氨基酸有限公司)；黄体酮注射液（浙江仙居制药有限公司生产）。

1.1.2.3 试剂 抗凋亡基因（Bcl-2）、增殖细胞核抗原（PCNA）免疫组化试剂盒（博士德生物技术公司生产）等。

1.2 实验方法

从“画家”“操纵者”“创造性叛逆”者等比喻可见，这一时期的译学研究赋予了译者前所未有的自由，充分肯定了译者在翻译中所起的重要作用，使其主体性得到进一步彰显。

1.2.1 实验分组 适应性饲养1周后将60只Wistar大鼠称取体质量后按随机数字表分为：空白对照组（A）、模型组（B）、乳癖消药物对照组（C）、通乳散癖汤低剂量组（D）、通乳散癖汤中剂量组（E）、通乳散癖汤高剂量组（F），每组各10只。经检测各组实验大鼠体质量无显著性差异。

1.2.2 实验步骤、流程

1.2.2.1 药品制备 本实验所涉及中药的剂量是根据临床对患者用药取得最好疗效剂量，参照实验动物与人之间体表面积比例与剂量换算[2]。按人（60 kg）单位体质量（kg）用药的8倍作为大鼠单位体质量用药，确定为中剂量，低剂量为中剂量的1/2，高剂量为中剂量的1倍，依据上述计算得出通乳散癖汤低、中、高剂量单位体质量大鼠每天生药用总量分别为：8.6、17.2、34.4 g/kg。其分别相当于临床有效治疗量的0.5倍、1倍、2倍。实验过程中将生药用自来水浸过药液面3 cm，浸泡30 min后用大火烧开，后改为小火煎30 min，取药液，置2倍以上容器内储存。再加水，量稍少于前次，大火烧开后改小火煎煮25min，滤药液，弃药渣，混合两次药液，慢火浓缩至每只大鼠3 mL/d的体积。每日剩余药液冷藏，用时量取各剂量组药液30 mL，加热至约20℃。乳癖消片研细末，单位体质量大鼠用药量为0.768 g/kg，溶于30 mL蒸馏水中，按每只大鼠3 mL/d的体积配制，随用随配。

1.2.2.2 造模及给药 参照文献报道的乳腺增生病模型造模方法[3]，除A组外其余各组均采用苯甲酸雌二醇联合黄体酮造模。A组腹腔注射生理盐水0.5 mg/（kg·d），连续25 d；B、C、D、E、F各组分别腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/（kg·d），连续20 d，继而改为黄体酮4 mg/（kg·d），连续5 d。造模开始后的第16天，在造模给药基础上同时给予药物治疗。造模给药与灌胃药物治疗间隔时间8 h。A、B两组实验大鼠给予蒸馏水灌胃3 mL/（只·d）；C组实验大鼠给予乳癖消片混悬液灌胃3 mL/（只·d）(含乳癖消0.192 g)；D组实验大鼠给予通乳散癖汤低剂量灌胃3 mL/（只·d）；E组实验大鼠给予通乳散癖汤中剂量灌胃3 mL/只·天；F组实验大鼠给予通乳散癖汤高剂量灌胃3mL/（只·d）。各组实验大鼠连续灌胃30d。

考虑到临床上乳腺增生病患者多在乳腺未发生明显病理增生，因乳房胀痛等不适提前就诊，故在本实验中治疗干预在造模开始后的第16天同时给予灌胃治疗。笔者认为此法既有利于控制实验条件，也更接近于临床治疗情况。

1.2.3 标本采集 实验结束前选取大鼠第2对乳腺组织用8%硫化钠涂抹于乳房周围进行脱毛处理；于末次灌胃给药后24 h，切取第2对乳腺组织,甲醛固定，石蜡包埋切片，送甘肃省人民医院病理科行免疫组化法检测抗凋亡基因（Bcl－2）、增殖细胞核抗原（PCNA）表达情况。

1.3 统计学处理 所有数据均输入计算机，采用SPSS13.0统计软件处理，实验数据均采用均数±标准差（±s）表示，各指标组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。当P<0.05时认为组间数据有统计学意义。

2 结果

免疫组化染色结果判断：Bcl－2阳性表达为细胞浆着棕黄色，PCNA阳性表达为细胞核着棕黄色。所有染色切片在同一条件下应用（BI-2000，成都泰盟科技有限公司）彩色病理图像分析系统进行相对灰度值的测定，随机选取5个最佳视野进行拍照（4×100倍）。用（±s）表示每例平均灰度值。通乳散癖汤对各组大鼠乳腺组织Bcl-2、PCNA的影响见表1。

表1 各组大鼠乳腺组织Bcl-2、PCNA阳性表达(±s)Tab.1 Expression of Bcl-2,PCNA of mammary gland ineach group in rats of each group(±s)

表1 各组大鼠乳腺组织Bcl-2、PCNA阳性表达(±s)Tab.1 Expression of Bcl-2,PCNA of mammary gland ineach group in rats of each group(±s)

注：A组与 B 组比较：ΔP＜0.01；各治疗组与 B 组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

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大鼠乳腺组织Bcl-2、PCNA阳性表达水平用平均灰度值表示。由表1可以看出：模型组Bcl-2、PCNA灰度值与空白对照组进行比较，有显著性差异（P<0.01）说明苯甲酸雌二醇联合黄体酮腹腔注射可诱导大鼠乳腺组织增生；治疗组与模型组比较结果显示Bcl-2、PCNA灰度值随治疗剂量的增加而呈现递增趋势，有统计学意义（P<0.05）。

研究表明灰度值愈小其阳性表达水平愈高，反之则表达水平愈低。对照表1结果可以得出：Bcl-2、PCNA阳性表达水平随着给药剂量的增加而降低。由此笔者得到以下结论：通乳散癖汤对于苯甲酸雌二醇联合黄体酮腹腔注射诱导的大鼠乳腺组织增生疾病具有拮抗作用。

3 讨论

3.1 动物模型的选择 本实验中，选用了抵抗力强，对激素敏感的Wistar大鼠，采用苯甲酸雌二醇联合黄体酮外源性激素腹腔注射方法进行造模。本造模方法具有操作简单、重复性好、成功率高的特点。经25 d造模，光镜下可见模型组乳腺小叶、腺泡上皮增生，导管扩张，间质水肿，腺腔、间质以及细胞核呈病理性改变，说明外源性雌激素异常刺激可造成动物乳腺增生病理模型，其乳腺病理与人体乳腺增生病理相类似，说明笔者已成功复制了大鼠乳腺增生病理模型。

3.2 关于对照药物的选择 乳癖消片药物组成为：鹿角、蒲公英、昆布、夏枯草、鸡血藤、三七、赤芍等，具有软坚散结、活血消痛、清热解毒功效，用于痰热互结所致的乳癖、乳痈。目前此药物在临床上较为常用，疗效较同类药物好。在药物组成上有相似性，均含有鹿角、夏枯草，但乳癖消选用鹿角其具有补肾助阳，活血散瘀消肿之功，补肾之功较弱，而通乳散癖汤选用鹿角霜具有益肾助阳，补力虽弱，但不滋腻，且有收敛作用。通乳散癖汤与乳癖消片具有较强的可比性。

3.3 组方分析 通乳散癖汤组成：仙茅、仙灵脾、鹿角霜、郁金、柴胡、浙贝母、川楝子、山慈菇各10 g，夏枯草、王不留行各15 g,天门冬20 g。本方主要针对乳腺增生病中肝郁肾虚及肾虚冲任失调证型而设。乳腺增生“本”在于肾气不足，冲任失调，肝失所养，肝气郁结；“标”在于痰凝、血瘀、气滞。病机特点为本虚而标实，故治疗以调理冲任，疏肝补肾为主，不忘化痰祛瘀散结。全方具有补肾助阳，调摄冲任，疏肝理气，养血和营，化痰软坚，调节内分泌等作用，从而调理冲任，维持女性正常生理平衡，有助于从根本上治疗乳腺增生病。

3.4 Bcl-2、PCNA在大鼠乳腺增生病中的表达 乳腺增生的发生及逐渐加重的过程是上皮细胞增殖过度和凋亡减弱共同作用的结果。Bcl-2基因作为细胞凋亡分子机制的重要调控点，成为影响乳腺导管上皮细胞凋亡的重要因素，而PCNA的表达作为衡量细胞增殖的可靠指标具有特异性[4]。

Bcl-2是种凋亡抑制基因，可抑制多种因素诱导的细胞凋亡，并在不影响细胞增殖情况下增强细胞存活力，参与细胞增殖与凋亡动态平衡的调控，其介导的细胞凋亡障碍，使遗传物质的突变率增加，从而参与多种肿瘤的发生发展过程[5]。

PCNA是一种分子量为3 600的核蛋白，是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，能较好地反映细胞进入增殖周期的状况，客观地评估肿瘤细胞增殖和生长速度。

综合上述可见Bcl-2与PCNA两者处于动态平衡之中。平衡失调则导致异常增殖，增殖细胞容易引起基因突变；而细胞不能正常凋亡势必引起细胞不断堆积，最终也易产生恶变。

在实验中笔者运用彩色病理图像分析系统进行相对灰度值的测定方法，从而取代了依据染色强度判定阳性结果的方法，较之该法更具有科学性。平均灰度值的大小与免疫组化阳性细胞表达数呈负相关性，即平均灰度值高者，阳性表达水平低，表明大部分肿瘤细胞处于G0期或静止期，DNA复制不活跃，增殖能力比较弱；相反，平均灰度值低者，阳性表达水平高，肿瘤细胞大部分处于增殖期，是增殖旺盛的表现。从实验结果中可以看出：Bcl-2与PCNA在正常组织和增生组织中均有分布，通乳散癖汤通过调整PCNA、Bcl-2的表达水平，从而达到抑制乳腺组织增生的作用，并具有一定的阻断乳腺增生向恶性转变的作用，最终达到干预治疗目的。此外,还发现通乳散癖汤对乳腺增生病的防治作用呈量效依赖关系,以高浓度作用显著。综上所述：通乳散癖汤能抑制乳腺增生病的进一步发展，具有治疗与预防的双重作用。由于细胞凋亡是一很复杂的多基因素参与、调控的结果，所以通乳散癖汤对乳腺增生病的调控的机制不是单因素的，对其他基因有无影响，以及是怎样的影响，有待于今后在临床和实验方面进行更深入的研究。

[1] 李中玉.乳腺增生病中西医诊治全书[M].北京:中国中医药出版社,2004：164-166.

[2] 郝光荣.实验动物学[M].上海:第二军医出版社,2002:276-276.

[3] 饶金才,李兰珍,陈云生,等.乳腺增生病动物模型的复制及病理类型[J].中国病理生理杂志,1992,8(6):671-672.

[4] 黄志清.Bcl-2基因及其在乳腺癌中的表达[J].中国肿瘤临床,1996,23(9):667-668.

[5] 阙 秀，董建强.乳腺肿物Bcl-2表达与激素受体的相关研究[J].诊断病理学杂志，1997，4（1）：25-27.

Effect of Tongru Sanpi decoction on expression of Bcl-2,PCNA of tissue of mammary glands
in rats with hyperplasia of breast glands

LI Chao-ping1，LU Yan-qing2
(1.Gansu College of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China;2.Pingliang Medicine College,Pingliang 744000,China)

[Objective]The aim of the present study was to detect correlation between gene expression of Bcl-2,PCNA and histology of hyperplasia of mammary glands and to explore the intervention therapy of Tongru Sanpitang on hyperplasia of mammary glands by studying the biological indicator of the cancer-changing tendency of hyperplasia of mammary gland.[Methods]Hyperplasia of mammary glands were induced in rats by intraperitonneal injection of Estradiol Benzoate and Progesterone.It was treated respectively by perfusion Tongru Sanpitang(high,middle and low doses)into stomach and in the control drug,Rupixiao was perfused into stomach.Expression of Bcl-2,PCNA in histological specimen of mammary glands in each group in rats was detected with IHC.[Result]Tongru Sanpi decoction could regulate the expression level of Bcl-2,PCNA of mammary glands in experimental rats.[Conclusions]Tongru Sanpi decoction can probably inhibit the hyperplasia of mammary glands by inhibiting cell proliferation and inducing cell apoptosis.

Tongru Sanpi decoction；hyperplasia of mammary glands；rats

R285.5

A

1672-1519(2011)01-0061-03

甘肃省自然科学基金暨中青年科技基金资助项目（3ZS041－A25－067）。

李朝平（1958－），女，教授，硕士研究生导师，主要从事中医妇科学教学和临床研究工作。

路艳清。

2010-07-16）

·临床报道·