特异性免疫玻片法在外周血T淋巴细胞亚群检测中的应用

吕卫东 张平安

特异性免疫玻片法在外周血T淋巴细胞亚群检测中的应用

吕卫东1张平安2

本文2010-07-06收到,2010-10-25接受

目前,T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+和CD 8+)的检测是观察机体细胞免疫功能的重要指标[1]。流式细胞术作为 CD3+、CD4+和CD8+T细胞检测的标准方法,由于仪器及配套检测试剂费用昂贵,难以在基层医院推广和应用。因此需要一种准确、简便、价廉的CD3+、CD4+和CD8+T细胞检测方法。本研究应用免疫玻片法检测全血CD3+、CD4+和CD8+T细胞,并与经典的流式细胞术进行比较,考察了两种方法的相关性,报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

120份全血标本来自本院住院患者和体检人群,其中住院患者100例,涉及的疾病有肿瘤、病毒性感染、自身免疫病、创伤、心血管疾病和糖尿病等。体检人群20例,为体检中各指标均正常的健康者。

1.2 仪器和试剂

Epics XL流式细胞仪及CD3+/CD4+/CD8+检测试剂均由美国Beckman-Coulter公司提供。CD3+、CD4+和CD 8+T细胞检测玻片及配套试剂均由上海汇中细胞生物科技有限公司提供。Sysmex SF3000型细胞分析仪及试剂,均由日本Sysmex公司提供。

1.3 方法

1.3.1 标本采集:采集静脉血2m l,EDTA抗凝后,2～8℃保存,分别用流式细胞术和玻片法检测CD3+、CD4+和CD8+T细胞数,同时进行全血细胞计数。

1.3.2 流式细胞术检测T淋巴细胞亚群:取CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE三色标记的单克隆抗体20μl加入Tru COUNT试管管底,然后加入抗凝新鲜全血 100μl,充分混匀,室温避光孵育30～60min,再分别加入溶血剂、缓冲液和固定液,其间振荡混匀,进行流式细胞术分析。检测前用标准荧光微球通过FACS Comp软件自动校准流式细胞仪,再上样进行 CD3+/CD4+/CD8+检测,得到全血中CD3+、CD4+和CD8+T细胞的百分数,结合全血细胞计数结果,换算得到CD 3+、CD4+和CD8+T细胞的绝对值(个/μl)。

1.3.3 免疫玻片法检测T淋巴细胞亚群:将20μl全血加入到 380μl磷酸盐缓冲液中混匀,分别取5μl稀释后全血加入到CD3、CD4和CD8抗体包被区,室温孵育40min,用磷酸盐缓冲液对玻片进行清洗,再用过氧化酶染色液通过细胞染色去除单核细胞等非特异性细胞,然后再用复染液对CD细胞进行染色。即可采用普通光学显微镜或自动计数仪对其进行计数,所得计数结果乘以4,即为每μl外周血中CD3+、CD4+和CD8+T细胞的数值。为保证检测的准确性和稳定性,检测前用标准片上机进行测试;检测完成后,再用标准片验证一次,要求两次结果均在控制范围内。

1.4 统计学处理

所有资料均输入计算机,应用描述性统计指标和t检验统计分析,并使用SPSS 11.0统计软件对两种方法所测得的CD3+、CD4+和CD8+T细胞数进行Pearson相关性分析和Bland-A ltman散点图分析。以相关系数(r)大于0.8表示两方法之间具有显著相关性,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 特异性免疫玻片法和流式细胞术的检测比较

两种方法检测CD3+、CD4+和CD8+T细胞的平均值、标准差以及中位数等的统计结果见表1。经t检验,免疫玻片法和流式细胞术检测的CD3+、CD4+和CD8+T细胞数差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 两种检测方法的结果比较

2.2 两种方法的相关性分析

免疫玻片法与流式细胞术检测CD3+T细胞的r为0.96,平均绝对误差为-21个细胞/μl;CD4+T细胞的 r为0.98,平均绝对误差为3个细胞/μl;CD 8+T细胞的r为0.94,平均绝对误差为26个细胞/μl,见图1。经统计学处理,两种方法检测的CD 3+、CD4+和CD8+T细胞数具有显著相关性。

图1 两种方法计数CD3+、CD 4+和CD8+T细胞的相关性

2.3 重复性试验

从120份全血标本中随机抽取20份,应用免疫玻片法分别检测两次CD3+、CD4+和CD8+T细胞,结果发现,CD3+、CD4+和CD 8+T细胞的变异系数(CV)分别＜7%、7%和12%。

3 讨 论

T淋巴细胞亚群是调控细胞免疫的主要细胞,大量研究表明,其绝对数和比值是衡量个体免疫状态及功能的重要指标[2]。流式细胞术是目前细胞CD分化抗原检测的标准方法,但由于仪器及检测试剂昂贵、检测人员需经特殊专业培训、仪器维护复杂等原因,很难在基层医院普遍推广应用。同时,流式细胞术检测的是CD3+、CD4+和CD8+T细胞占淋巴细胞总数的百分比,只能显示T淋巴细胞亚群的构成比例,无法直接反映各亚群细胞的绝对水平[3],若要获得各亚群细胞的绝对数量,需进行全血细胞计数后再换算,操作较复杂。

本研究所用的免疫玻片法突破传统的特异性细胞检测思路,采用逆向思维,即不用抗体来标记细胞,而是用事先包被有特异性抗体的玻片来捕捉游离的CD3+、CD4+和CD8+T细胞,通过洗涤除去非特异CD抗原表达细胞,再用细胞化学染色法区分T淋巴细胞与单核细胞,然后利用计算机系统控制普通光学显微镜进行 T淋巴细胞亚群计数。本文对120例不同人群全血CD3+、CD4+和CD8+T细胞检测结果表明,免疫玻片法与流式细胞术具有显著相关性和较小的检测差异,而且重复性好。因此,免疫玻片法检测T淋巴细胞亚群,具有操作简便、经济适用等特点,可较好满足健康体检人群及贫困边远和卫生资源缺乏地区对T淋巴细胞亚群检测的需要,同时可为病人减轻经济负担,使其更广泛的应用于免疫相关疾病的辅助诊断、病程监测及疗效评估。

本文第一作者简介:

吕卫东(1967～),男,汉族,主管技师

1 陈伟烈,袁小平,唐小珍,等.登革热病毒感染者外周血 T淋巴细胞亚群数量的变化及其临床意义.中国人兽共患病学报,2006,22(11):1 042～1 044.

2 杨 波,祁岩超,卢敏莹,等.流式细胞术分析六类肿瘤患者外周血淋巴细胞绝对值的变化.实用肿瘤学杂志,2006,20(2):81～83.

3 Bisset LR,Lung TL,Kaelin M,et al.Reference values fo r peripheral blood lymphocy te phenol-types applicab le to the healthy adult population in Sw itzerland.Eur J Haem atol,2004,72(3):203～212.

特异性免疫玻片法在外周血T淋巴细胞亚群检测中的应用

吕卫东,张平安/湖北省蕲春县第三人民医院检验科,蕲春435300

目的:探讨一种非流式T淋巴细胞亚群检测的新方法。方法:采用特异性免疫玻片法对120份全血CD3+、CD4+和CD8+T细胞进行检测,并与流式细胞术检测结果进行相关性分析。结果:两种方法检测 CD3+、CD4+和CD8+T细胞的相关系数(r)分别为0.96、0.98和0.94,平均绝对误差分别为-21个细胞/μl、3个细胞/μl和26个细胞/μl。统计学处理发现,两种方法检测CD3+、CD4+和CD8+T细胞的结果差异无统计学意义(P＞0.05)。结论:免疫玻片法可准确进行全血T淋巴细胞亚群计数,并具有试剂价格低廉、操作简单的特点,适用于基层和卫生资源缺乏地区的医疗机构。

R331.3+5

A

1005-1740(2011)01-0051-03

1湖北省蕲春县第三人民医院检验科,邮政编码 蕲春435300;2武汉大学人民医院检验科; 通讯作者:张平安,E-mail:zhangpingan@yahoo.com.cn

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