依维莫司对高糖诱导肾小球系膜细胞凋亡的保护作用

程 澜

依维莫司对高糖诱导肾小球系膜细胞凋亡的保护作用

程 澜

本文2010-08-03收到,2010-11-01修回,2010-11-08接受

糖尿病肾病是最常见的肾功能衰竭的病因。高血糖对肾脏内多种细胞都有促凋亡作用,尤其对肾小球系膜细胞的促凋亡作用最为明显,其凋亡程度可以独立地与糖尿病肾病患者肾功能损害程度相关[1]。依维莫司是雷帕霉素的衍生物,2008年被美国FDA批准为晚期肾癌的化疗药物。本文报道依维莫司保护肾小球系膜细胞,避免高糖诱导其凋亡的实验观察结果。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)购自中国典型培养物保藏中心(China Center For Type Culture Collection,简称 CCTCC),来源于 SD大鼠。DM EM低糖培养基(Gibco,批号:31600034)、DMEM无糖培养基(Gibco,批号:11966025)购自美国 Invitrogen公司。胎牛血清(Hyclone,批号:SH 30406.01H I)购自新西兰Thermo Fisher Scientific公司。碳酸氢钠、青霉素、链霉素、D-葡萄糖、D-甘露醇、DMSO购自美国Sigma公司。依维莫司(批号:S1120)购自美国Selleck Chemicals公司。Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自美国Bender M edSystems公司。光吸收酶标分析仪(96孔,VM ax动力学检测模式)购自美国M olecular Devices公司。BD FACSCalibur流式细胞分析仪购自美国BD Biosciences公司。

1.2 细胞培养和依维莫司溶液配制

HBZY-1细胞于 DMEM低糖培养基(含 5.6mM葡萄糖)或DMEM低糖培养基加4.4g D-葡萄糖(含30mM 葡萄糖)或DMEM无糖培养基加5.4g D-甘露醇(含 30m M甘露醇)中培养。选择含30mM葡萄糖培养基中加入不同浓度依维莫司进行有关实验。

依维莫司溶液配制:取1mg依维莫司溶于1m l DMSO中,用无菌三蒸水分别稀释为 100μg/m l、50μg/m l、20μg/m l、10μg/m l,备用 ,-20℃储存。实验时再稀释100倍。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 成活细胞计数:将HBZY-1细胞以1×104个/孔种植于96孔细胞板上,24h后,将对数生长期的细胞分为8组:空白对照组(不加细胞);阴性对照组(含5.6mM 葡萄糖);甘露醇对照组(含30mM 甘露醇);阳性对照组(含30mM 葡萄糖);药物组1(含30mM 葡萄糖和100ng/m l依维莫司);药物组2(含30mM 葡萄糖和200ng/m l依维莫司);药物组3(含30mM 葡萄糖和500ng/m l依维莫司);药物组4(含30mM 葡萄糖和1 000ng/m l依维莫司)。培养72h后,用10%的三氯乙酸固定,水洗后,用磺酰罗丹明B染色。未结合的磺酰罗丹明B用1%的冰乙酸洗净;与蛋白结合的磺酰罗丹明B被T ris碱抽提出来,在490nm波长处用酶标仪读数,记录OD值,计算细胞存活率。

计算结果显示,药物组2细胞存活率最高(87.67±3.06%),故采用200ng/m l依维莫司行细胞凋亡实验。

1.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡:采用A nnexin V和碘化丙啶(PI)双染法对凋亡细胞进行观察,具体操作如下:将大鼠 HBZY-1细胞分为5组:阴性对照组(含5.6mM葡萄糖);甘露醇对照组(含30mM甘露醇);阳性对照组(含30mM葡萄糖);依维莫司组1(含30mM葡萄糖和200ng/m l依维莫司)和依维莫司组2(含5.6mM葡萄糖和200ng/m l依维莫司)。细胞以1×106个/孔种植于6孔板中,贴壁24h,大约在细胞达到60%融合度后,移走培养基,用PBS洗细胞3遍,用无血清培养基于37℃孵育24h后,加入依维莫司(200ng/m l)干预 72h,然后用胰酶消化,在Buffer液体中重悬,调整细胞浓度为5×105个/m l,加FITC结合的Annexin V和PI孵育5min,上流式细胞仪分析细胞凋亡。流式细胞仪激发光波长采用Ex.=488nm双波长,Em.=530nm,检测FITC荧光和＞575nm的发射光检测PI。Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测;PI红色荧光通过PI通道(FL3)检测。活细胞仅有很低的荧光强度,早期凋亡细胞有较强的绿色荧光,晚期凋亡细胞有绿色和红色荧光双重染色。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 不同浓度依维莫司对葡萄糖诱导的大鼠HBZY-1细胞存活率的影响

30mM甘露醇对细胞存活率无明显影响,说明该渗透压水平不影响细胞存活率;30mM葡萄糖对细胞存活率有明显影响。4种浓度依维莫司都能逆转高浓度葡萄糖对大鼠HBZY-1细胞生长的抑制作用,其中以200ng/m l依维莫司效果最好。见表1。

2.2 200ng/m l依维莫司对不同浓度葡萄糖诱导的大鼠HBZY-1细胞凋亡率的影响

30mM葡萄糖较之5.6mM葡萄糖能更明显增加大鼠HBZY-1细胞的早期凋亡和晚期凋亡;200ng/m l依维莫司能有效逆转高浓度葡萄糖的这种促凋亡作用。见表2和图1。

表1 不同浓度依维莫司对高糖诱导的大鼠HBZY-1细胞存活率的影响(±s,n均=30)

表1 不同浓度依维莫司对高糖诱导的大鼠HBZY-1细胞存活率的影响(±s,n均=30)

注:与阳性对照组比较,1)P＜0.05;与药物组1,药物组3,药物组4比较,2)P＜0.05

阴性对照组 甘露醇对照组 阳性对照组 药物组1 药物组2 药物组3 药物组4细胞存活率(%) 100.00 96.33±1.53 44.00±4.581) 72.33±6.511)87.67±3.061)2)69.00±4.001) 51.67±3.511)

表2 200ng/m l依维莫司对不同浓度葡萄糖诱导的大鼠HBZY-1细胞凋亡率的影响(±s,n均=6)

表2 200ng/m l依维莫司对不同浓度葡萄糖诱导的大鼠HBZY-1细胞凋亡率的影响(±s,n均=6)

注:与阳性对照组比较,1)P＜0.05

阴性对照组 甘露醇对照组 阳性对照组 依维莫司组1 依维莫司组2早期凋亡率(%) 2.57±1.17 2.33±0.55 26.83±4.29 2.60±0.651) 2.70±0.96晚期凋亡率(%) 7.71±1.09 8.45±1.60 26.67±4.75 7.71±1.491) 8.44±2.17

图1 200ng/m l依维莫司对不同浓度葡萄糖诱导的大鼠HBZY-1细胞凋亡率的影响

3 讨 论

糖尿病肾病是糖尿病常见的微血管并发症之一,病变初期,肾小球和肾脏体积增大,肾脏体重比增加,平均肾小球和肾小管直径增加。随着病程的进展,肾脏体积缩小,肾小球结节状硬化,肾小管萎缩。糖尿病肾病肾脏细胞的这种由增生到萎缩的变化,其发生机制尚未完全阐明。有报道糖尿病肾病发展过程中随着病变进展,肾脏实质细胞,包括肾小球固有细胞和肾小管上皮细胞逐渐减少,这一细胞减少过程与肾脏细胞过度凋亡有关[2]。既往曾经观察到1型糖尿病动物模型肾组织中凋亡细胞数较非糖尿病肾脏明显增多,并伴有促凋亡基因Bax上调和抗凋亡基因Bcl-2下调[3]。对2型糖尿病肾病病人的临床研究报告称,肾小球细胞的过度凋亡和糖尿病肾病肾小球纤维化密切相关。在糖尿病肾病的肾组织中,肾小球、肾小管、血管内皮细胞凋亡广泛存在。但肾小球系膜细胞的凋亡最为重要,能独立反映肾小球滤过率的降低[1,4]。本实验表明,高血糖能增加大鼠肾小球系膜细胞早期凋亡和晚期凋亡。预防和改善高血糖对肾小球系膜细胞凋亡的药物能有效延缓糖尿病肾病的发生和发展。

mTOR(The M olecu lar Target of Rapamycin)是细胞内信号通路中的重要靶点,参与调控细胞生长、增殖、血管形成、自噬和代谢[5]。m TOR抑制剂依维莫司是雷帕霉素(Rapamycin)的类似物,它在体内和FK结合蛋白12结合为一个复合体,该复合体抑制m TOR,并能阻止细胞从G1期到S期[6]。研究表明,m TOR抑制剂能减轻糖尿病小鼠肾脏肥大,改善肾间质纤维化,减少蛋白尿。因此,抑制m TOR成为治疗糖尿病肾病和肾脏纤维化的新靶点[7,8]。

现有研究认为,m TOR抑制剂治疗糖尿病肾病的机制是抑制肾小球细胞增殖,改善肾小球肥大;抑制成纤维细胞增殖和胶原合成,改善肾间质纤维化;抑制基质蛋白质合成,改善肾小球基底膜增厚和细胞外基质堆积;抑制炎症细胞浸润和细胞因子释放。本实验通过SRB法和流式细胞术证实该类药物能抑制高血糖导致的细胞凋亡,从而为这类药物治疗糖尿病肾病提供了新的理论依据。有多种凋亡信号通路参与高糖诱导肾实质细胞凋亡的过程,然而,仅有Caspase-9在高糖培养的人肾小球系膜细胞中活性增加[9]。因此推测,依维莫司抑制高糖诱导HBZY-1细胞凋亡的分子机制,是抑制细胞中Caspase-9活性。m TOR抑制剂是否对其他肾实质细胞具有同样的抗凋亡效应,以及其抗凋亡的具体机制,有待进一步研究。目前对细胞凋亡和糖尿病肾病之间的关系多集中于周细胞、血管内皮细胞和肾小管上皮细胞的研究[10～12],肾小球系膜细胞凋亡和糖尿病肾病发生发展的机制研究较少。本实验为这一研究提供了新思路。

本文作者简介:程 澜(1976～ ),女,汉族,主治医师,博士研究生,研究方向为糖尿病肾病

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依维莫司对高糖诱导肾小球系膜细胞凋亡的保护作用

程 澜/华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科,武汉430030

目的:观察依维莫司对高糖诱导肾小球系膜细胞(HBZY-1)凋亡的保护作用,并探讨其意义。方法:将培养HBZY-1细胞按不同葡萄糖和依维莫司浓度分组处理72h后,用磺酰罗丹明B法测量细胞OD值,计算各组细胞存活率,用A nnexin V和PI双标法检测各组细胞凋亡率。结果:30mM 葡萄糖处理的细胞存活率明显降低,凋亡率明显增加(均P＜0.05)。不同浓度依维莫司均能提高细胞存活率(均P＜0.05),其中以200ng/m l依维莫司效果最好(P＜0.05);200ng/m l依维莫司具有明显抗HBZY-1细胞凋亡作用。结论:依维莫司对高糖诱导HBZY-1细胞凋亡具有保护作用,从而为其治疗糖尿病肾病提供新的研究方向。

The Protec tive Effec tof Evero limus on High Glucose Induced Apop tosis of Mesangia l Ce lls

Cheng Lan/Departmento f Cardio logy,Tong jiH ospital,Tongji M edical Collegeof H uazhong University of Science and Technology,W uhan 430030

Everolimus;Mesangial cell;Apoptosis

R979.1

A

1005-1740(2011)01-0015-04

华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科,邮政编码 武汉430030

Objective:To research the protective effect of everolimus on high glucose induced theapoptosis ofmesangial cells and discuss thesignificance.Method:We collected and divided HBZY-1 cells.A fter treating cellswith agent for72h,w edetectedOD values with SRBmethod to calculate the cellsgrowth rateand detected apoptosis cells rate with flow cytometry.Results:The grow th rate ofmesangial cells treated with 30mM glucosewas significan tly decreased and theapoptosis ratewassignificantly increased(P＜0.05).The different concentrationsof everolimusm igh t raise the grow th rate of cells(P＜0.05),in w hich the effect of200ng/m leverolim usw as thebest(P＜0.05).Meanw hile,200ng/m l everolim us could significantly prevent the apoptosis of cells.Conclusion:Everolimus cou ld prevent high glucose induced the apoptosis of mesangial cells,so there is a new method for the treatment of diabetic neph ropathy.

依维莫司 肾小球系膜细胞 凋亡