12-脂氧化酶基因敲除对1型糖尿病肾病小鼠肾小球内纤维连接蛋白表达的影响

李龙镐,陈 志,孙珉丹,尹 悦,李 佳,王婉宁,臧崇森,许钟镐*

众多实验研究均证实动脉粥样硬化、高血压、糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）等严重影响人类健康的疾病与白细胞型12-脂氧化酶（12-lipoxygenase,12-LO）的表达增加有密切的关系[1-4]。12-LO的激活在肾病的发生、发展过程中起着至关重要的作用[1,2]。肾脏细胞肥大和细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）堆积是DN的特征性病变。早期研究证实了DN时12-LO主要通过介导细胞反应的重要信号通路—MAPK信号通路的一个途径—p38 MAPK信号通路引起ECM堆积,而另外两个MAPK信号通路—ERK和JNK信号通路无此介导作用[5-7]。然而,12-LO能否直接参与DN时肾小球细胞肥大过程,目前还不清楚。很多研究已明确纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）是DN时肾小球肥大的标志性蛋白。本研究首次探讨1型DN时12-LO基因敲除对肾小球内FN表达的影响,为12-LO在DN时肾小球纤维化过程中的作用提供最直接的依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 FN,β-actin抗体（美国Santa Cruz公司）,RNA STAT-60试剂（美国 Tel-Test Inc）,RT-PCR试剂盒、Taq DNA聚合酶和dNTP（德国 Boehringer Mannheim GmbH）,18S引物（美国Ambion Inc.）,免疫组织化学试剂盒（美国Dako Corporation）。

1.2 动物实验 体重为22-25g的野生型和12-LO基因敲除C57BL/6小鼠（美国Jackson Laboratories）随机分成4组:野生型对照组（n=8;WT）;12-LO基因敲除组（n=8;LOKO）;野生型糖尿病组（n=8;WT+STZ）;12-LO基因敲除糖尿病组（n=8;LOKO+STZ）。小鼠禁食12小时。模型组小鼠一次性腹腔注射STZ（200mg/kg,溶于pH4.2,0.1mol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液,冰浴新鲜配制）,48小时后经小鼠尾静脉采血测血糖,以随机血糖高于300mg/dL为糖尿病模型成功。对照组注射等量的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。16周后处死动物。实验结束前留取24小时尿,测血糖、称重,乙醚麻醉小鼠,心脏取血,取出右肾称重,采用系列过筛方法分离肾小球,在-70℃保管。

1.3 RT-PCR 取冻存的肾小球,用RNA STAT-60试剂一步法提取肾小球的总RNA。用RT-PCR试剂盒合成cDNA。逆转录体系包括1μg总RNA、10×PCR buffer,1 mmol/L dNTP,5mmol/L Mgcl2,0.5μg oligo（dT）,15U AMV逆转录酶,20U RNA酶抑制剂。反应条件为30℃10分种,42℃30分种,99℃5分种,5℃5分种。小鼠FN引物序列为:正链5′-GCACAACAGACCACCAAACTCG-3′, 反 链 5′-CTGAAGTCACTTCTCGGGGTGCG-3′,扩增片段大小 430 bp。PCR反应条件:95℃,预变性3分种,循环条件:94℃变性30秒,56℃退火30秒,72℃延伸1分种,循环结束后72℃延伸7分种,进行循环35次。最后各PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶（含0.5mg/L溴化乙锭）中电泳,于紫外线灯下拍照。为了半定量PCR产物,将胶片上反应条带在图像分析仪中扫描。

1.4 免疫组织化学检查 石蜡切片常规脱蜡水化;1%H2O2作用15分钟,PBS洗;0.05%胰蛋白酶液37℃作用30分钟,PBS洗;10%正常山羊血清孵育15分种抑制非特异性结合;滴加FN一抗,4℃过夜,PBS洗;滴加二抗（生物素化兔抗鼠IgG）,37℃孵育30分钟,PBS洗;滴加复合物（链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液）,37℃孵育30分钟;DAB显色,水洗后用苏木素复染,透明封片。每批均设有阴性对照。

2 结果

2.1 动物的一般情况分析 与野生型对照组比较,野生型1型糖尿病小鼠血糖（P＜0.01）、肾重/体重比值（P＜0.01）和24小时尿白蛋白明显增高（P＜0.01）,但12-LO基因敲除糖尿病小鼠尿白蛋白（P＜0.05）、肾重/体重比值（P＜0.05）明显低于野生型糖尿病小鼠,见图1。

图1 各组小鼠血糖、肾重/体重比值及24小时尿白蛋白的变化

2.2 RT-PCR结果分析 基础情况下,野生型和12-LO基因敲除小鼠肾小球FN mRNA表达无差异。与野生型对照组相比,野生型糖尿病小鼠肾小球FN mRNA表达明显增加（P＜0.01）,但12-LO基因敲除可阻止糖尿病小鼠肾小球FNmRNA表达的增加（P＜0.05）,见图 2。

2.3 免疫组织化学检查分析 基础情况下,野生型和12-LO基因敲除小鼠肾小球FN蛋白表达无差异。与野生型对照组相比,野生型糖尿病小鼠肾小球FN蛋白表达明显增加,但12-LO基因敲除可阻止糖尿病小鼠肾小球FN蛋白表达的增加,见图3。

3 讨论

图2 各组小鼠肾小球内FN mRNA表达的变化

图3 各组小鼠肾小球FN免疫组织化学检查结果（×400）

12-LO是一种不饱和脂肪酸的氧合酶,它以花生四烯酸为基质生成相应的氢氧化二十碳四烯酸12-HETE。目前研究已证实12-LO及其代谢产物主要通过氧化应激反应和炎症反应参与多种疾病的病理过程,如冠状动脉粥样硬化、高血压、DN等[1-4]。近期的研究已明确12-LO、TGF-β和AngⅡ之间存在着相互协同作用[5-7]。12-LO通过p38MAPK信号通路引起肾小球ECM积聚,其作用在关于DN发病机制的研究中得到一些证实[5-7]。然而,12-LO是否直接参与DN时肾脏肥大及肾小球ECM积聚,目前尚无相关报道。

众所周知,高糖在DN的发生和发展中起关键的作用。高糖是引起糖尿病合并症的导火线。美国的1441例1型糖尿病病人的DCCT的前瞻性研究和英国对2型糖尿病的UKPDS研究明确地提出,严格控制血糖至接近正常水平可以有效地延缓DN的发生。Bleich和Han等的研究为糖尿病时抑制12-LO来保护胰腺β细胞而延缓血糖升高的设想提供了线索,其依据为:1）12-LO的代谢产物12-HETE破坏胰岛β细胞的正常功能而降低胰岛素的分泌[4];2）一些细胞因子通过12-LO的介导而破坏胰岛β细胞的功能[4];3）COX-2的代谢产物—前列腺素破坏胰腺β细胞的功能,抑制12-LO可以减弱COX-2的表达,进而减少前列腺素的合成,从而阻止胰腺β细胞发生功能障碍[8];4）STZ诱导糖尿病的12-LO基因敲除的小鼠,其血糖在模型成功后一个月内明显低于野生型糖尿病小鼠[3]。我们的研究发现,用STZ诱导糖尿病的12-LO基因敲除的小鼠,其血糖在模型成功后16周时仍低于野生型糖尿病小鼠,但统计学上无明显差异。我们的结果证实通过抑制12-LO的活性可以阻止胰腺β细胞发生功能障碍而延缓血糖升高。

DN主要病理特征是肾小球细胞肥大、ECM堆积进而发生肾小球硬化。在本研究中,为了证明12-LO是否直接参与DN时肾脏肥大及肾小球ECM积聚,我们采用了12-LO基因敲除小鼠。基因敲除小鼠技术的建立和发展使得科学家们能够从分子、细胞及动物整体水平研究特定基因在生物发育、生理以及病理中的作用,对生命科学的发展具有革命性的意义,对临床疾病的认识和治疗也起到了关键的推动作用。肾小球ECM的主要成分为IV型胶原、层粘连蛋白和FN。很多研究已明确FN是DN时肾小球肥大和ECM积聚的标志性蛋白。我们的研究证实,与对照组比较,糖尿病小鼠的肾重/体重比值明显增高,但12-LO基因敲除糖尿病小鼠肾重/体重比值明显低于野生型糖尿病小鼠,从而证明12-LO直接参与DN时肾脏肥大。病理学检查和RT-PCR结果表明,与对照组相比,野生型糖尿病小鼠肾小球内FN明显增加,但12-LO基因敲除可直接阻止糖尿病小鼠肾小球内FN表达的增加。本实验结果表明,1型糖尿病小鼠肾小球内FN增加与蛋白尿的增加同步,但12-LO基因敲除可阻止糖尿病小鼠肾小球内FN增加与蛋白尿进展。总之,12-LO可直接诱导肾小球内FN的表达上调,加速DN肾小球肥大及DN的进展。因此,通过抑制12-LO来阻止糖尿病肾小球内FN的表达对延缓DN的进展具有重要的意义。

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