影响血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验结果的常见因素及相应对策

贺智英

延安大学医学院，陕西延安 716000

醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜作支持物的一种区带电泳技术，因其有快速省时、分辨能力强、操作简单、成本低廉、透明后利于扫描定量及长期保持等优点，被广泛应用于血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、核酸及其他生物大分子的分析检测，已成为医学和临床检验的常规技术，血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验也成为了生物化学实验课程必开的基础实验项目之一。但该实验影响因素很多，每个环节的失误都会对实验结果产生影响而得不到理想的图谱，并且还造成很大浪费。笔者结合多年的实验教学经验对影响本实验结果的常见因素进行分析探讨，并提出了相应的解决对策。现报道如下：

1 电泳前准备的影响因素

1.1 醋酸纤维薄膜的因素

1.1.1 醋酸纤维薄膜的选择 醋酸纤维薄膜如果厚度不一、粗面细孔不均、脆性不一，在电泳时会出现区带不均匀、白色斑点处蛋白质不泳动而影响图谱的效果[1]。对策：①购买知名度相对高的正规厂家生产的产品；②将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，如漂浮20 s左右时，膜片出现白斑点或条纹，应舍去不用[2]。

1.1.2 醋酸纤维薄膜的浸泡 由于醋酸纤维薄膜亲水性比较低，浸泡时间过短，不能保证膜片上有一定量的缓冲液，难以使其恢复原来多孔的网状结构，所以浸泡时间不少于30 min。浸泡时用镊子将纤维薄膜条粗面向下平稳放入缓冲液中，使其自然湿润沉下液面或用手轻摇装液外盒，不要用镊子、玻棒等器材按压纤维素薄膜沉下液面，也不要同时将多条纤维素薄膜一起放进缓冲液盒。

1.2 标本的因素

1.2.1 血清标本的新鲜度 不新鲜血清标本蛋白质电泳图谱α2与β之间可能会多出现一条粗而染色均匀的区带，也可能会出现电泳图谱区带不清晰，比较离散，甚至有拖尾现象[1]。有研究证明，在2～8℃冰箱保存血清标本，第1天与第2天标本中各蛋白质组分百分比变化无统计学意义，从第3天开始，标本中白蛋白百分比下降，α1-球蛋白、α2-球蛋白和β-球蛋白百分比上升均有统计学意义[3]。因此，必须使用新鲜的血清，如新采取血清标本不是马上用，则必须放4℃冰箱贮存保鲜，但时间最多不能超过48 h。

1.2.2 溶血标本 溶血标本中白蛋白降低，α2-球蛋白、β-球蛋白升高。严重溶血时可见α2、β球蛋白区带重叠，区带百分比增加[4]，因此应采用清亮无溶血的血清标本。

1.2.3 点样标本的替代 有文献报道，在实验教学中用鸡蛋白（鸡蛋清∶缓冲液=1∶9）代替血清作为点样样品，加样量约 3 μl，可取得卵转铁蛋白、卵白蛋白、溶菌酶和卵黏蛋白4条电泳区带[5]。用鸡蛋白作为实验材料，既取材方便，又能节约成本。

1.3 缓冲液的因素

1.3.1 缓冲液的离子强度及pH值 缓冲液的离子强度应为0.06，pH应为8.6。如离子强度过低缓冲容量小，不易维持缓冲液的pH值恒定，同时导致样品所载电流增加，电泳速度加快，带电颗粒在介质上扩散严重，分辨力明显降低，区带展开延长，导致区带拖尾[6]。pH过高、过低也会影响实验结果。研究证实，随着电泳次数的增加，巴比妥缓冲液的pH发生变化，且阳极变化明显，导致电流强度、蛋白迁移率、蛋向区带均变小，故巴比妥缓冲液实验6次左右就应更换，否则会发生明显拖尾现象[7]。对策：①选择没有失效的分析纯药品；②用电子天平准确称取药品，精确到0.001 g；③配好后用pH计校正；④学生多次使用时，应在每次电泳前将正负两极的缓冲液混匀再分别加入电泳槽两极，保证缓冲液pH值稳定或重新配置新的缓冲液。

1.3.2 缓冲液的替代 巴比妥缓冲液中巴比妥有毒性，长期接触会对人体产生伤害，且实验教学中大量使用费用较贵。有实验证明，用硼酸缓冲液（离子强度：0.08；pH 8.6）代替巴比妥缓冲液能得到更清晰、更理想的电泳图谱[8-9]。硼酸缓冲液连续电泳实验10次蛋白仍可分离清晰，这样既减少了避免了巴比妥对操作者的伤害，又减少了成本。

1.4 点样的因素

点样是本实验关键的一步，点样前薄膜的准备、点样器的选择、点样位置的选择、点样的量的多少都直接影响最后图谱的效果。

1.4.1 点样前薄膜的准备 浸泡好的薄膜吸得过干，电泳时电流不易通过薄膜，样品在薄膜上流动困难，易导致电泳图谱有条痕；亦不能留存过多的缓冲液，以避免点样时血清随着缓冲液而扩散开来，导致电泳图谱分离不齐[10]。因此只要用滤纸轻轻吸取薄膜上的多余水分即可。

1.4.2 点样器的选择 传统用载玻片端面点样，因其宽度稍大于薄膜宽度，点样血清会横跨薄膜，产生明显的边缘效应，且有拖尾现象。有文献报道，用自制点样器（将宽为1.3 cm的订书针折成0.4 cm宽，抛光，再将两头插入小块有机玻璃作为手柄）得到的电泳图谱中蛋白质条带无边缘效应，也无明显拖尾现象[11]，并且可以在同一张薄膜上点样两次，在实验教学中可增加学生的训练次数。

1.4.3 点样位置的选择 点样太靠薄膜边缘，易产生边流现象；点在薄膜光泽面上，则血清不能渗入薄膜，图谱不清晰。所以应点在无光泽面距边缘1.5～2.0 cm处，点样线与薄膜短边平行。

1.4.4 点样的量 点样的量太多易导致电泳图谱分离不良或产生拖尾现象；点样的量太少会使图谱区带显色过浅。加样量的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关，如电泳后要用洗脱法定量时，每厘米加样线上加样量为 0.1～0.5 μl，相当于 5～1000 μg；如是血清蛋白常规电泳分离时，加样量不超过每厘米 1 μl，相当于 60～80 μg。对策：对每一种样品的加样量应先做预实验；点样前应在滤纸上反复练习，掌握点样技术后，再以印章法使点样后的样品呈一条线涂于纤维薄膜[12]。

2 电泳时的影响因素

2.1 搭桥

根据电泳槽裁剪大小合适的滤纸或脱脂纱布，使其对折后一端的长边能浸入缓冲液中，另一端的长边与支架前沿对齐。待滤纸完全浸透后，用玻璃棒轻轻挤压膜支架上的滤纸或纱布以驱赶气泡，使其紧贴在膜支架上[13]。

2.2 平衡

薄膜倾斜放置，电泳图谱会出现要靠近阳极越窄。薄膜搭在滤纸桥时应将无光泽面向下，点样端放在负极，加样线距离桥垫2 mm左右；膜条要紧贴滤纸桥不能有气泡；膜条要拉直，不能下垂。盖上电泳槽盖平衡10～15 min。

2.3 通电

2.3.1 通电电压电流 电压过高，图谱展开短，蛋白质各组分之间出现挤压，区分困难；反之，以低电压进行电泳时，样品泳动速度慢且易扩散，所呈现的图谱常有“拖尾”现象。总电流要根据放入膜条的多少计算后调节，如果太大会将膜条烧断[6]。按电场强度10～12 V/em（指薄膜与滤纸桥总长度），电流强度0.5～0.8 mA/em膜宽（指薄膜数目的总宽度）进行计算，并以控制电流大小为主效果较好[14]。

2.3.2 通电时间 电泳时间的长短跟室温是密切相关的，具体可待电泳区带展开3.5～4.0 cm后关闭电源。

3 电泳后的影响因素

3.1 染色

染色时间过长，薄膜底色难以脱掉，时间过短，区带不易区分；多条薄膜放入染液时重叠易致染色不良。因此薄膜应一条一条逐次放入染液，保证前一条薄膜染色固定后再放入下一条，并轻轻摇动染色杯，染色10 min即可。

3.2 漂洗

漂洗液成分主要为乙醇，易发挥，所以应密封保存或在临用前配制。为节省洗液，用镊子将薄膜从染液中取出时尽量沥去染液。另外，温度对薄膜漂洗结果也有影响，如室温过低，可将漂洗杯放入恒温水浴箱，不能超过25℃，能提高漂洗效率，又不影响实验结果[15-16]。因此，只需准备3杯漂洗液，将薄膜依次放入3份洗液中，每次5 min即可达到漂洗的目的。

综上所述，影响血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验的因素很多，在实际操作过程中想要得到理想的图谱而又不造成浪费和污染，就必须选择最佳的操作条件和操作方法，尽量避免和减少上述影响因素的影响，以达到临床检验和教学实验的目的。

[1]翁闪凡,庄锡伟.醋酸纤维薄膜法血清蛋白电泳的影响因素分析与对策[J].检验医学与临床,2010,7(6):502-503.

[2]卢韫,王顺昌,汪承润,等.血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验教学的优化设计[J].生物学杂志,2010,27(4):103-106.

[3]韦丽华,王金祥,支国华,等.血清储存时间对蛋白电泳结果影响的探讨[J].云南医药,2007,28(6):540-542.

[4]梁惠强,牛映红,梁佩婵.溶血因素对血清蛋白电泳结果的影响分析[J].现代预防医学,2011,38(5):939-940.

[5]陈国华,熊泽,邹坤.蛋白质醋酸纤维薄膜电泳点样方法[J].世界华商经济年鉴·高校教育研究,2008,5(5):224.

[6]邱雁临,夏服宝,康旭.提高醋酸纤维薄膜电泳实验成功率的探讨[J].实验科学与技术,2008,6(2):6-8,12.

[7]伊德林,江岩,李咏.醋纤蛋白电泳法巴比妥缓冲液使用时效的分析[J].沈阳医学院学报,2005,7(2):125.

[8]宋凤艳,詹嘉红.两种缓冲液条件下人血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳结果的比较[J].韩山师范学院学报,2008,29(6):67-68.

[9]尹丽,王永和,何弘水.硼酸缓冲液应用于电泳实验的效果分析[J].实验室科学,2010,13(2):154-155.

[10]王长凤,赵志彬,刘亚辉.如何做好血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验[J].中国中医药现代远程教育,2009,7(12):277-278.

[11]冀华,潘登奎.改进点样器对血清蛋白膜电泳分离效果的影响[J].山西农业大学学报,2010,30(6):564-567.

[12]张晶,徐学甫.电泳分离血清蛋白实验探讨[J].黑龙江医药,2008,21(3):52-53.

[13]康美玲,田忠景.醋酸纤维薄膜电泳实验技术的探讨[J].中国校外教育,2009,(12):59.

[14]孙莉丽,李荣华.醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白实验的改进[J].实验室科学,2010,13(2):58-59.

[15]杨留才,成玉生.温度对血清蛋白醋纤膜电泳漂洗的影响[J].第四军医大学学报,2008,29(18):1714.

[16]尹丽,陈秀敏,王永和,等.血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳几种缓冲液的效果分析[J].中国医学创新,2010,7(11):145-146.