大孔树脂吸附纯化桑黄粗多糖的研究

张慧洋， 秦俊哲

(陕西科技大学生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 前 言

桑黄，又名鲍氏层孔菌Phellinusigniarius，是目前发现的生物抗癌领域有效率高的大型真菌[1]，其活性成分主要是多糖.桑黄多糖具有抗肿瘤、抗菌、抗纤维化、抗氧化等药理作用[2]，将其纯化后得到的相对较纯的多糖可更好地发挥作用.鉴于大孔吸附树脂成本低、工艺简单、效率高、再生性强、可重复使用等优点，本文采用大孔树脂吸附纯化桑黄粗多糖，并对其特性进行了研究，以期为桑黄粗多糖的进一步纯化提供一种简单有效的方法，也为实现桑黄多糖的工业化利用提供理论参考.

1 材料和方法

1.1 材料

桑黄：陕西科技大学微生物菌种保藏室提供；桑黄粗多糖：水提醇沉法制得.

1.2 仪器

HYG-IIa旋转式恒温调速摇瓶柜(上海鑫蕊自动化设备有限公司)，756PC紫外可见分光光度计(上海光谱仪器)，层析柱(20×400)(江苏省高邮市亚泰科教仪器厂).

1.3 主要试剂

苯酚、浓硫酸、95%乙醇、葡萄糖等，均为分析纯.

1.4 试验方法

(1)多糖测定：苯酚-硫酸法[3]，得回归方程y=0.340 1x-0.010 6，R2=0.998 8.

(2)大孔树脂的预处理： 95%乙醇浸泡24 h，湿法装柱，95%乙醇以2 BV·h-1(BV指树脂的床体积，单位mL)的流速通过树脂柱，水洗至中性没有醇味为止；5% HCl溶液以4 BV·h-1流速进行酸洗，浸泡4 h，水洗至中性；再用5% NaOH溶液以4 BV·h-1流速进行碱洗，浸泡4 h，水洗至中性，即处理完毕.

(3)静态吸附-解吸附试验.在100 mL锥形瓶中，加入1 g预处理过的大孔树脂和20 mL多糖液，密封振荡(110 r·min-1，30 ℃)24 h，抽滤，测吸附前后溶液中多糖的含量；将饱和树脂置于100 mL锥形瓶中，加入25 mL洗脱剂(以蒸馏水和70%乙醇作对比)，密封振荡(110 r·min-1， 30 ℃)24 h，抽滤，筛选出纯化多糖性能最好的树脂以及解吸效果好的洗脱剂.

(4)动态吸附-解吸附试验.将目的树脂湿法装柱，桑黄多糖液(流速1 mL·min-1)上样，1 BV收集一管，测定多糖含量，确定最佳上样量.吸附饱和后，洗脱剂洗脱(流速1 mL·min-1)，部分收集器收集，5 mL收集一管，考察多糖的解吸情况，确定最佳洗脱剂用量.

(5)计算.吸附量、吸附率和解吸率的计算见参考文献[5].

2 结果与讨论

2.1 静态试验

2.1.1 大孔吸附树脂的筛选

图1 5种树脂对多糖的吸附和解吸情况 图2 5种树脂对粗多糖中蛋白吸附性能的紫外扫描曲线(1.多糖样品液, 2.D101, 3.DM301, 4.DS401, 5.DA201, 6.D-101-I)

由图1知，5种树脂对多糖的吸附率变化差异不显著，对比乙醇和水做洗脱剂时，乙醇的洗脱率高于水.因蛋白质在280 nm处有最大吸收，故测得样品溶液在280 nm处的吸光度值，可粗略估计溶液中的蛋白含量.为了进一步确定5种树脂的脱蛋白性能，对树脂吸附后的多糖液在200～800 nm区间进行了紫外扫描(图2).由图2知，经树脂处理过的多糖液在280 nm处吸收值均明显低于原液，D-101-I的下降最多，且对多糖原液中吸收波长在300～400 nm的杂质有很好的脱除作用，有利于多糖的进一步分离纯化.综合考虑，以D-101-I为目的树脂，乙醇为洗脱剂做进一步的动态试验.

2.1.2 吸附等温线

图3 D-101-I的吸附等温曲线 图4 D-101-I的吸附动力学曲线

由图3知，随着溶液中多糖浓度的增大，树脂的吸附量也随之增大，当浓度大于500 mg·L-1时，吸附逐渐缓慢.

2.1.3 吸附动力学

由图4知，在起始阶段树脂吸附量随时间增加较快，随着时间延长吸附量增加缓慢，240 min时基本达到平衡.

图5 pH对多糖吸附量的影响

2.1.4 pH对多糖吸附率的影响

由图5知，在pH为5～6时对多糖的吸附量最多，这是因为多糖液的pH值为5.5，主要以分子形式存在，故易被树脂吸附，由此，采用原液直接上柱进行下一步的动态试验.

2.1.5 乙醇浓度对树脂解吸率的影响

由表1试验结果可见，在乙醇浓度为50%时，解析率最大，随乙醇浓度的进一步增加，解析率减小，故选用50%的乙醇作洗脱剂.

2.2 动态试验

2.2.1 上样量对树脂吸附性能的影响

图6 上样量与多糖吸附率关系曲线 图7 洗脱剂用量与多糖解吸率关系曲线

由图6知，随上样量的增加，树脂的吸附率逐渐降低.在上样量为1～6个柱体积时，树脂对多糖的吸附量较大，速度快，接近饱和，而在9个柱体积时，树脂对多糖的吸附已趋于平衡，此时树脂吸附饱和.综合考虑，选用6 BV作为最佳上样量.

图8 洗脱液多糖的紫外扫描图

2.2.2 洗脱剂用量对树脂解吸性能的影响

由图7知，随着洗脱剂用量的增加，多糖的洗脱率先增加后降低，在1 BV时，达到最高90%，2个柱体积时可基本把多糖洗脱完.在第4～7管(即20～35 mL)的多糖浓度很高，说明多糖被富集洗脱下来.合并洗脱液，去除乙醇，在200～400 nm进行紫外扫描，由图8可知，在280 nm处基本没有峰，说明洗脱液中蛋白含量低，故选洗脱剂用量为2 BV.

2.3 树脂的重复利用率

由表2可以看出，当树脂重复使用3次后，其吸附容量会下降到50%以下，需进行再生处理.

表1 乙醇浓度对多糖解吸率的影响

表2 树脂的重复利用率

3 结束语

作者通过试验比较了5种大孔吸附树脂对桑黄粗多糖的吸附-解吸性能，研究发现D-101-I树脂对桑黄多糖有较好的纯化作用.纯化桑黄多糖的最佳工艺条件如下：多糖液浓度为500 mg·L-1，吸附240 min达到平衡，平衡吸附量为80 mg·g-1，多糖原液直接上柱，最佳上样量为6 BV；50 %乙醇作洗脱剂，用量为2 BV时，可将树脂上的多糖大部分洗脱下来，且洗脱液中蛋白及杂质含量较少，多糖纯度较高.

参考文献

[1] 戴玉成.药用担子菌——鲍氏层孔菌(桑黄)的新认识[J] .中草药,2003,34(1):94-95

[2] 孙淑静,江玉姬,朱 虎,等.药用真菌桑黄的研究现状[J] .药物生物技术, 2005,12(2):138-140.

[3] 李芙蓉,吕 博.刺五加多糖的微波萃取及含量测定[J].新疆中医药,2003,21(1):11.

[4] 惠贤民.大孔树脂吸附纯化桑葚多糖的研究[J].宁夏师范学院学报(自然科学)，2008,29(6):39-42.