超声波协同酶法提取陕北滩枣总黄酮的研究

杨芙莲, 聂小伟, 康 银

(陕西科技大学生命科学与工程学院, 陕西 西安 710021)

0 前 言

红枣中含有丰富的黄酮类化合物，黄酮类化合物能增强人体内Vc的作用，促进Vc在人体内的积蓄，使人体血脂胆固醇降低，防止血管硬化.黄酮类化合物还可以减小血管通透性，降低其脆性，是预防和治疗高血压的有效成分[1]，当前在医药和保健食品领域有很广泛的需求和应用.

目前黄酮类化合物的提取绝大多数采用乙醇等有机溶剂为浸提剂，存在生产成本较高、产品有机溶剂残留等问题，以水为浸提剂的方法还很少见报道.超声波在植物有效成分的提取方面应用较为广泛[2]，主要是利用其空化效应破坏植物细胞壁，从而有利于有效成分的溶出.由于植物的细胞壁主要由纤维素、木质素和果胶等物质构成，而红枣果肉中纤维素和果胶含量较高，所以红枣中的纤维素和果胶可能是制约红枣总黄酮最大限度溶出的主要物质.本研究中果胶复合酶含有纤维素酶和果胶酶等，能特异性降解纤维素和果胶，破坏细胞壁，使细胞内总黄酮最大限度地溶出[3].用超声波同步协同果胶复合酶提取陕北滩枣总黄酮的研究实验尚未见报道，本文对超声波协同果胶复合酶提取陕北滩枣中总黄酮的工艺条件进行了优化，为陕北滩枣中黄酮类化合物的深度开发利用提供了理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红枣：陕北清涧黄河滩枣，水分含量27.44%；果胶复合酶(酶活力：果胶酶≥40万U/g、纤维素酶≥10万U/g、木聚糖酶≥20万U/g、β-葡聚糖酶≥20万U/g):宁夏和氏璧生物技术有限公司;芦丁(生化纯);磷酸氢二钾、柠檬酸、亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇均为分析纯.

722型光栅分光光度计:上海光谱仪器有限公司；电热恒温水浴锅:北京长安科学仪器厂；PHS-3C酸度计:上海雷磁仪器厂；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵:巩义市予华仪器责任有限公司；电热鼓风干燥箱:北京科伟永兴仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂；BS323S型分析天平:塞多利斯科学仪器有限公司(北京)；KQ-250TDV高频数控超声波清洗器:昆山市超声波仪器有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

准确称取干燥至恒重的芦丁对照品20 mg，加入10 mL甲醇置于水浴锅微热使其溶解，冷却，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，浓度为0.2 mg/mL的芦丁溶液.精确吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL上述芦丁标准溶液，分别置于10 mL比色管中，加60%乙醇至5 mL，再加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，静止6 min，然后加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，静止6 min后加1 mol/L氢氧化钠2 mL，再加蒸馏水至刻度，摇匀，静止15 min，并以相应试剂为空白在500 nm处测定吸光值，然后以芦丁浓度-吸光度值作图，用最小二乘法进行线性回归，得到芦丁溶液浓度C和吸光度A关系的回归方程及相关系数分别为A=10.757C+0.009 9和r=0.997 1.

1.2.2 提取工艺流程

原料→挑选→洗净→烘烤→破碎→称量→浸提→抽滤→减压浓缩→冷却→显色→测定总黄酮得率

颅骨缺损一般是由重型颅脑损伤等原因导致颅内压增高[1]，为了达到满意的效果，进行去骨瓣减压术导致，当然还有一部分患者则是因为病损颅骨切除或外伤性颅骨骨折清创而遗留颅骨缺损[2]。近年来随着医疗技术的发展，数字成型钛板修补已广泛用于临床[3]，极大的满足了患者对自然度和美观度的要求，但该手术后却存在一些并发症，极大的降低了钛板颅骨修补术成功率[4]。本研究回顾我院2015年1月—2017年1月收治的80例颅骨缺损患者临床资料，分析钛板颅骨修补术后并发症的处理及防治措施，报道如下。

1.2.3 总黄酮得率的计算

式中C—提取液中总黄酮的浓度(mg/mL)；m—样品质量(g)；V—提取液定容体积(mL)；n—稀释倍数.

2 结果与讨论

2.1 加酶量对超声波协同酶法提取效果的影响

取40 g经预处理的红枣样品，在pH 4.5，加水量为10 mL/g，超声波功率为200 W，温度为45 ℃，超声波酶解时间为60 min的条件下，考察不同加酶量对红枣总黄酮得率的影响.

图1 加酶量对红枣总黄酮得率的影响 图2 加水量对红枣总黄酮得率的影响

由图1可知，随着加酶量的增加，红枣总黄酮得率不断提高；当加酶量超过100 mg/100 g时总黄酮得率增加开始显现出相对减缓的趋势.这是因为果胶复合酶中果胶酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶对植物细胞壁主要组成成分有降解作用，破坏了细胞壁，加速了黄酮化合物的溶出，从而利于红枣中总黄酮的提取[4].

2.2 加水量对超声波协同酶法提取效果的影响

取40 g经预处理的红枣样品，在pH 4.5，加酶量为100 mg/100 g，超声波功率为200 W，温度为45 ℃，超声酶解时间为60 min的条件下，考察不同加水量对红枣总黄酮得率的影响.

由图2可知，随着加水量的增加，红枣总黄酮得率不断提高，在加水量达到14 mL/g时，总黄酮得率最大.这是由于在酶解时加水量的增加使得细胞内外浓度差增大，有利于红枣中总黄酮的溶出.当加水量大于14 mL/g时，红枣总黄酮得率反而降低.原因可能是加水量过大，降低了酶和底物的浓度，从而减少了酶分子与底物分子的碰撞几率，使得底物未充分酶解而破坏，导致总黄酮的溶出效果变差.

2.3 时间对超声波协同酶法提取效果的影响

取40 g经预处理的红枣样品，在pH 4.5，加酶量为100 mg/100 g，超声波功率为200 W，温度为45 ℃，加水量为14 mL/g的条件下，考察不同处理时间对红枣总黄酮得率的影响.

图3 时间对红枣总黄酮得率的影响 图4 超声波功率对红枣总黄酮得率的影响

由图3可知，在提取时间小于70 min时，随着提取时间的延长，红枣总黄酮得率增加迅速.原因可能是超声波产生的瞬间空化高温和局部高压随时间的积累可加速红枣中总黄酮的溶解，另外随酶解时间的增加，蛋白酶会使细胞的破坏更完全，从而加速总黄酮的溶出.当提取时间大于70 min后，红枣总黄酮得率增加趋于平缓，这是因为长时间的超声波处理会使酶失活，导致破坏细胞壁的能力下降，从而总黄酮的溶出能力下降.同时，底物含量也会不断下降，浓度差的推动力减弱，最后总黄酮在溶剂中达到溶解平衡.

2.4 功率对超声波协同酶法提取效果的影响

由图4可知，随超声波功率增大红枣总黄酮得率相应提高，超声波功率达到200 W时红枣总黄酮得率最高.这是因为超声波功率越大，空化作用和机械作用越强烈，分子扩散速度也就越大，总黄酮渗出就越多.但在超声波功率超过200 W后，总黄酮得率反而减小.这可能是由于功率过大，超声时瞬间热效应过于明显，使得局部温度过高导致蛋白质酶变性失活，破坏细胞壁的能力丧失，从而影响了总黄酮的溶出.

2.5 温度对超声波协同酶法提取效果的影响

取40 g经预处理的红枣样品，在pH 4.5，加酶量为100 mg/100 g，时间为70 min，微波功率为200 W，加水量为14 mL/g的条件下，考察不同温度对红枣总黄酮得率的影响.

图5 温度对红枣总黄酮得率的影响 图6 pH对红枣总黄酮得率的影响

表1 正交试验因素水平表

由图5可知，随着温度的上升红枣总黄酮得率不断升高，当温度达到45～50 ℃时总黄酮得率达到最大，超过50 ℃时，随温度的升高总黄酮得率急速降低.这可能与果胶复合酶的最适作用温度有关，当酶解温度偏离其最适温度时不利于果胶复合酶作用，从而不利于总黄酮的提取.温度较低时，果胶复合酶活力不能充分发挥，导致细胞不能被充分破坏；而温度过高导致果胶复合酶失活，从而影响了细胞壁主要成分的降解，最终影响了总黄酮的提取，因此45～50 ℃为酶解的最佳温度范围[5].

2.6 pH对超声波协同酶法提取效果的影响

取40 g经预处理的红枣样品，在加酶量为100 mg/100 g，时间为70 min，微波功率为200 W，加水量为14 mL/g，温度为45 ℃的条件下，考察不同pH对红枣总黄酮得率的影响.

由图6可知，红枣总黄酮得率随pH的升高而增加，在pH 4.5～5.0时总黄酮得率达到最大；当pH超过5.0时，总黄酮得率随pH的升高而下降.可能的原因与果胶复合酶的最适宜酶解pH有关，当酶解pH偏离其最适pH时不利于果胶复合酶的作用，对红枣细胞壁的分解破坏能力减弱，并对红枣总黄酮溶出产生不利影响.因此，果胶复合酶最适宜pH为4.5～5.0[6].

表2 正交试验结果

2.7 正交试验优化

在前期预实验中，发现红枣浆液pH在4.5～5.0之间，恰好在果胶复合酶最适宜pH范围内，故为了简化实验过程，在正交优化试验中不对pH的相应水平进行优化.在单因素实验的基础上，选取对超声波协同果胶复合酶提取红枣总黄酮得率影响较大的因素各水平进行正交试验优化，并选用L9(34)正交表，各因素水平见表1，正交试验结果与极差分析见表2.

由表2可见，超声波协同酶法提取红枣总黄酮得率影响因素的主次顺序为：时间>功率>温度>加水量，最佳水平组合为A1B1C3D1，即加水量13 mL/g，超声功率175 W，时间80 min，温度40 ℃，pH 4.5，此时总黄酮的得率为2.61%，明显高于同等工艺条件下果胶复合酶和超声波单独提取的效果[7].

对所得优化条件进行验证实验，即在加酶量100 mg/100 g，pH 4.5，加水量13 mL/g，超声功率175 W，时间80 min，温度40 ℃条件下进行实验，红枣总黄酮得率为2.72%，和正交试验结果基本相符.

3 结论

通过单因素实验和正交试验，确定了超声波协同果胶复合酶提取红枣中总黄酮的最佳工艺条件为：加酶量100 mg/100 g，pH 4.5，加水量13 mL/g，超声功率175 W，时间80 min，温度40 ℃，此时总黄酮的得率为2.61%.超声波协同果胶复合酶提取红枣中总黄酮可以提高效率，缩短浸提时间，节约成本，提高总黄酮含量，明显优于同类传统提取方法.

参考文献

[1] 霍文兰, 刘步明, 曹艳萍.陕北红枣总黄酮提取及其抗氧化性研究[J].食品科技，2006,(10)：45-47.

[2] 李铭芳，席 峰，李清龙，等. 红枣中生物黄酮的提取及分析方法研究[J]. 江西农业大学学报，2009，31(06)：1 156-1 159.

[3] 孙 萍，马彦梅，廉宜君，等. 正交试验优化沙枣果肉中黄酮的酶辅助提取研究[J]. 中草药，2009,40(13):165-167.

[4] 魏 明，邵 平，姚 红，等.超声波协同纤维素酶法提取霍山石斛多糖的研究[J].食品工业科技，2009,30(03)：199-201.

[5] 杨 柳，江连洲，李 杨，等.超声波辅助水酶法提取大豆油的研究[J].中国油脂，2009,34(12)：10-14.

[6] 周连文，张存兰，刘新华. 酶辅助超声波提取何首乌多糖及其抗氧化性研究[J].食品科技，2008,(01)：170-173.

[7] 韩志萍.陕北红枣中总黄酮的提取及含量比较[J].食品科学，2006，12(11)：560-562.