DNA序列分析用于常见致病真菌鉴定和分型

赵正娟 田伟 赵敬军，2

(1.福建医科大学协和临床医学院皮肤科，福州 350001;2.同济大学附属同济医院，上海 200065)

近年来，随着医疗水平的提高，器官移植、骨髓移植等侵入性治疗增多，临床免疫抑制剂、糖皮质激素使用增加，人群免疫力降低，导致真菌感染机会增加。传统的菌种鉴定方法 (如分泌物直接镜检、培养、生理生化方法)费时费力(真菌生长速度在2 d～3周不等)，存在阳性率低和需要专业人员操作等局限性。而侵袭性真菌病病死率较高，病情发展迅速，为了快速准确地诊断疾病，做到早诊断、早治疗、降低死亡率，分子生物学方法开始用于菌种鉴定。这些方法包括:限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、扩增片段长度多态性分析 (AFLP)、单链构象多态性(SSCP)、随机扩增多态性DNA分析(RAPD)、末端片段长度多态性分析 (tFLP)、脉冲凝胶电泳法(PFGE)、DNA序列分析及多位点序列分型(MLST)等。DNA序列分析方法用于研究生物分类和进化，可以克服DNA指纹法的局限性。大量的性状可以直接观察到，如碱基的变化与颠换，不活动性与有选择性，核苷酸的变化趋势，这些变化在物种系统发育分析时都可以以不同的方式表现出来，公开发表的序列都可以直接用来进行比较和分析。

1 DNA序列分析的应用

DNA序列分析对于了解真菌的基因结构、表达及分子进化关系等具有十分重要的意义。序列测定是对致病真菌分类鉴别的重要手段。目前应用较多的为18 S rRNA基因大亚基的D1-D2区、基因内间隔区IGS(intergenic spacer)、内转录间隔区ITS(internal transcribed spacer)、蛋白编码区和一些管家基因。其中ITS区最为常用。主要原因包括:核糖体上的5.8 S、18 S和28 S rRNA基因有极大的保守性，即存在着广泛的异种同源性。而由于ITS区不加入成熟核糖体，所以ITS片段在进化过程中承受的自然选择压力非常小，因此能容忍更多的变异。在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性，即使是亲缘关系非常接近的2个种都能在ITS序列上表现出差异，显示最近的进化特征。ITS1和ITS2是中度保守区域，其保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显。这种特点使ITS区适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。真菌ITS区长度一般在550～750 bp(碱基对)，片段较小、易于分析。而且目前已有该区扩增所需的标准通用引物。GenBank等机构已存在该区标准序列，可以供各实验室进行比对。但ITS区一般仅能把菌种鉴定到种复合体水平，需要利用一些蛋白编码区，如β-微管蛋白基因 (βtubulin gene)、钙调蛋白基因 (calmodulin gene)、延长因子-1α 基因 (EF-1α，elongation factor-1α gene)等序列分析把菌株鉴定到种水平。

2 致病真菌鉴定及分型

2.1 致病性念珠菌

引起念珠菌病的主要临床致病菌是白念珠菌。但由于免疫缺陷患者数量的日渐增加以及鉴定技术的进步，近来发现非白念珠菌及某些新变种正在增加。这些新变种存在天然耐唑类药的菌种，比如克柔念珠菌、光滑念珠菌对氟康唑不敏感，又因深部念珠菌病致死率较高，亟需找到快速准确的鉴定方法，以便于选择敏感药物进行治疗，对指导临床有重要意义。

早期较多研究人员仅对念珠菌rRNA基因ITS区进行序列分析。如Frutos RI等［1］对念珠菌该区扩增后的序列分析，把念珠菌鉴定到种复合体水平，但有的相似菌株不能鉴别出来;同样，Ciardo DE等［2］对113株临床重要酵母菌ITS区测序并与数据库比对序列，其中98%菌株被鉴定到种水平，只对ITS1区或ITS2区分析有些菌株就能鉴定到种水平，但联合应用ITS1-5.8S-ITS2区效率更高。

近几年研究人员多倾向于应用多位点序列分型方法 (multilocus sequence，MLST)对念珠菌进行基因分型。MLST是通过PCR来扩增6～8个管家基因片段，采用DNA测序方法来比较核苷酸序列多态性，从而进行真菌种内分型。Arianna T等［3］对 COX3、L1A1、SADH、SYA1 等 4 种基因进行序列分析，发现原来属于近平滑念珠菌II组和III组的菌株实际属于Candida orthopsilosis和Candida metapsilosis;Chowdhary A 等［4］比 较 了MLST和Ca3特异性探针对白念珠菌分型分辨力的高低，MLST应用 7个管家基因 CaAAT1a、CaACC1、CaADP1、CaPMI、Ca-SYA1、CaVPS13、CaZWF1b测序，把来自口腔念珠菌病的37株菌分为23个基因型，鉴别指数 (辛普森指数，simpson＇s index of diversity)为97%。Ca3特异性探针法把它们分为21个基因型，鉴别指数为95%。结果表明:在确定白念珠菌基因型时，MLST法类似于或优于Ca3特异性探针法;Norbert B等［5］对38株光滑念珠菌的RPM2、MTI、Cg6等3个微卫星标记和ERG11基因测序，把它们分为14个基因型。随后对其中选定的10株菌的 PDR1、NMT1、TRP1、URA3等4个基因片段测序，发现它们属于这14种基因型中的5种。MLST对于白念珠菌具有高度分辨力，该技术简便易行，其结果可以共享，利于实验室间进行比较，随着测序的自动化，它将被广泛应用。http://calbicans.mlst.net上提供了白念珠菌的MLST数据库。

2.2 致病性曲霉

侵袭性曲霉病 (Invasive aspergillosis，IA)是临床上发病率较高的机会致病性真菌感染。好发于严重免疫缺陷病患者，已成为白血病、骨髓移植、器官移植患者继发感染的重要死亡原因，预后极差，病死率高。曲霉属中约有30种机会致病菌，但主要是烟曲霉、黄曲霉、土曲霉，尤以烟曲霉为主。从分类学上，曲霉属 (genus)被分成7个亚属 (subgenera)，亚属又分为几个组 (section)，有人把组(section)称作种复合体 (species complex)，以便于区分种复合体水平和种水平。例如，烟曲霉种复合体是指烟曲霉亚属，烟曲霉组。

早在2000年，Travis H 等［6］就利用 ITS区对曲霉标准株、临床株和其他属菌株进行研究，先用PCR扩增该区，然后测序，进行DNA序列分析，结果和GenBank的非标准株进行比对(在此研究之前，GenBank的ITS区序列数据是不完整的或者有些来自于非标准株)，把曲霉属与其他属菌株分离出来，如念珠菌属、隐球菌属、青霉属、镰刀菌属等，并把曲霉属鉴定到种水平，几种常见菌群均能鉴别出来，如黄曲霉、烟曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黑曲霉等。

随后几年里，曲霉属DNA序列分析比较普遍的围绕在rRNA基因的 ITS区、大亚基的 D1-D2区。为了比较两区哪个更可靠，Hans PH等［7］对曲霉株rRNA基因ITS区和大亚基的D1-D2区的鉴定效率进行评定，对13株临床重要曲霉株测序，各区序列与GenBank数据库序列进行比对，结果发现应用ITS区鉴定菌株更可靠，尤其在鉴别相似曲霉株时。rRNA基因的ITS区能把曲霉属鉴定到种复合体水平，但对一些形态学相似株无法鉴别。为了克服这一难题，有些研究人员引入一些蛋白编码区在种复合体内鉴定菌株。如S.Arunmozhi Balajee等［8］对烟曲霉的变异株做了种系发育学分析，即对5种基因所在区进行测序:β-微管蛋白基因、细胞色素B基因、ITS区等，然后进行序列分析，得出此变异株为烟曲霉姊妹株A.lentulus。同年，Seung-Beom H等［9］利用同样的方法做了更进一步的研究，对烟曲霉变异株的β-微管蛋白、钙调蛋白、肌动蛋白等基因测序，结果发现烟曲霉应分为 4 个群:A.fumigatus sensu stricto，A.lentulus，A.fumigatiaffinis，A.novofumigatus。Ja＇nos V 等［10］对曲霉临床株和其他来源的菌株进行形态学和分子生物学方法的分析，对β-微管蛋白基因、钙调蛋白基因及ITS区测序，结果确定原本属于焦曲霉组的菌株实际上属于A.calidoustus组。

总之，近年来的研究表明:ITS区可以把曲霉属鉴定到种复合体水平，而β-微管蛋白、钙调蛋白等蛋白编码区在种复合体内鉴定菌种，能把部分相似株或姐妹株鉴定到种水平。

2.3 致病性镰刀菌

近几年来，镰刀菌已成为引起人类机会感染的一种重要丝状酵母菌，临床重要镰刀菌主要包括6个组［11］:茄病镰刀菌种复合体 (FSSC)、尖孢镰刀菌种复合体(FOSC)、赤霉镰刀菌种复合体 (GFSC)、双孢镰刀菌种复合体 (FDSC)、厚孢镰刀菌种复合体 (FCSC)、人肉-木贼镰刀菌种复合体(FIESC)。镰刀菌分型研究的常用位点包括:RNA聚合酶Ⅱ大亚基(RPB2)、EF-1α、rRNA基因的ITS区和大亚基的D1-D2区、β-微管蛋白、钙调蛋白等基因区。

2006～2009 年的几年间，Kerry O＇Donnell的实验室对镰刀菌菌株鉴定以及基因分型做了大量的研究。2006年 Ning Zhang和 Kerry O＇Donnell等［12］对471株茄病镰刀菌 (278株来自于人，21株来自于医院环境，172株是其他来源的菌株)进行研究，通过对4个基因片段 (麦角固醇生物合成基因 (erg-3基因)、翻译延长因子1-α(TEF-1α)、rRNA基因的ITS区和大亚基的 D1-D2区)序列分析，发现茄病镰刀菌组分为45个种系发育相关的种，首次把茄病镰刀菌种复合体分为3个分枝，来源于人类的菌株主要在第3分枝，但人类来源的菌株和土壤、植物、动物来源的菌株有种系发育关系上的亲缘性。2007年，Kerry O＇Donnell等［13］通过对 RNA聚合酶Ⅱ大亚基 (RPB2)、rRNA基因ITS区、EF-1α基因序列分析，以及单独对RPB2基因序列分析，均把镰刀菌分为6个组，把亲人株归为第3分枝，包括了18个种系发育相关的种。为了完善这一假说，2008年Kerry O＇Donnell等又采取了新方法分析rRNA基因大亚基的D1-D2区、RPB2基因、EF-1α基因序列，认为所有与人真菌病致病相关的菌株都属于第3分枝，包括了至少20种种系发育相关的种。2009年，Kerry O＇Donnell等［14］应用 MLST 对人肉-木贼镰刀菌种复合体和厚孢镰刀菌种复合体进行鉴别，从88株人肉-木贼镰刀菌中鉴别出62种序列类型，从26株厚孢镰刀菌中鉴别出20种序列类型。TEF-1α、rRNA基因的 ITS区、大亚基的 D1-D2区、RPB2、钙调蛋白等基因序列对人肉-木贼镰刀菌种复合体和厚孢镰刀菌种复合体的鉴别指数分别为0.985和0.966。利用以上方法，原来被归为人肉-木贼镰刀菌种复合体或厚孢镰刀菌种复合体的4株亲人株和2株亲动物株，鉴定为5种新菌株，此前这5种菌株未被报道能引起人类真菌感染。

除了以上研究人员应用的MLST外，有些研究人员仅对单个位点进行测序，然后做序列分析，就能鉴定菌株到种复合体水平。如Ana AI等［15］分析了EF-1α基因序列，把镰刀菌属鉴别到种复合体水平，即分为 6个组，与以上分组一致;F.thapsinum和轮状镰刀菌在形态学上的鉴别是有争议的，Mónica Azor等［16］对两组菌的 β-微管蛋白基因进行测序，然后经BLAST程序分析，发现4株原来属于轮状镰刀菌种复合体的菌株实际上属于F.thapsinum菌种复合体;Rafael AO等［17］对来源于眼角膜炎患者的菌株rRNA基因的ITS区进行检测，发现与眼角膜溃疡感染相关的4种主要菌株为:茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌、人肉-木贼镰刀菌、双孢镰刀菌。

最新研究:2011年李若瑜等［18］对36株 (其中包括11株参考株和25株临床株)镰刀菌做了MLST以及聚合酶链反应-反向线点杂交技术(PCR-reverse line blot)的分析。他们选择7个区(TEF-1α、rRNA基因的 ITS区、LSU区、IGS区、RPB2基因、线粒体小亚基mtSSU、钙调蛋白基因等)对镰刀菌鉴定及分型，把它们鉴定到组。还采用了PCR-RLB技术，通过选定IGS区作为靶区设计探针鉴定菌种，经对比两种方法得出结论一致。但是PCR-RLB方法成本较高，而且还需要对更多菌株进行重复试验才能确定它的可行性。2.4 其他致病真菌

除了以上致病真菌，DNA序列分析也用于其他致病真菌的鉴定和分型。Patrick S等［19］对54株16种接合菌纲的菌株(包括根霉属、犁头霉属、毛霉属、根毛霉属等)做了研究，分析ITS区序列，把它们和其他属菌株分辨出来，而且ITS区的种内相似性大于98%，种间差异显著，足以鉴别到种复合体水平。

为了建立根霉属的分子发育史，2006年，Ayumi Abe等［20］对rRNA基因的18S区、ITS区、28S的D1-D2区测序，作出种系发育相关树形图，把根霉属分为3个分枝，这与形态学分类一致，形态学上根霉属分为3个群。2007年他们又用同样的方法对4个独立的基因区(rDNA的ITS区、ldhB基因、act1基因、TEF-1α基因)测序，然后做树形图分析，把米根霉分为两个种:产乳酸的米根霉和产富马酸-苹果酸的R.delemar。Nyilasi I等［21］通过对高亲和力铁通透性酶(FTR1)基因序列分析，可以把并头状菌属和根霉属鉴别开，并能把根霉属鉴定到种水平，还能把Mucor-Backusella群和其他菌群区分出来。Hsin CL等［22］应用rRNA基因的ITS区、D1-D2区序列分析，对皮肤癣菌进行分类，把皮肤癣菌鉴别为小孢子菌属、表皮癣菌属、毛癣菌属。以前被认为是趾间毛癣菌的菌株实际上是须癣毛癣菌，而且把红色毛癣菌和犬小孢子菌鉴定到种水平。Fanrong Kong等［23］对42株皮肤癣菌的rRNA基因的ITS区序列分析，把这42株菌分为7种:红色毛癣菌、须癣毛癣菌、地球毛癣菌、断发毛癣菌、絮状表皮癣菌、犬小孢子菌、石膏小孢子菌。

3 小 结

以上研究表明，DNA序列分析是一种敏感性高、特异性好的鉴定菌种的方法。关键问题是选择哪个目的扩增区，当决定用哪一个区或用区的数目时，要考虑一个重要的问题，就是是否需要把每株菌都鉴定到种水平。有些偶发菌株不具有代表性，在不了解它们在疾病中所起角色时，耗资鉴定这些菌株到种水平是浪费资源的。如果只需鉴定到种复合体水平，选择ITS区就足够了，临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)制定了真菌和细菌通过DNA靶基因测序鉴定的判定标准［24］，其中对真菌最普遍的靶点ITS区序列分析的质控做了详细描述。如果研究对象是高危人群，鉴定到种水平能显示疾病病原体，帮助选择和监控抗真菌药的疗效，并有助于流行病学调查以便得出有效控制感染的措施，这时要选择多位点序列分析方法。

由于传统的形态学鉴定方法耗时，缺乏统一的结果判定标准，主观性强，菌株表型特征多变，且需要专业人员操作，给一些临床真菌实验室带来了不便。DNA序列分析方法以客观、重复性好等优势，越来越受到各临床真菌实验室的青睐，已成为鉴别致病真菌的最可靠方法。尽管还存在一些待完善之处:GenBank数据库还不完整，有些基因序列无法比对;DNA序列分析成本较高，不适于较大样本的菌株鉴别;对临床真菌实验室硬件要求较高。但我们相信，在不久的将来，这些问题能迎刃而解，使DNA序列分析方法广泛应用于鉴定致病真菌，同时我们也应该看到，这些方法并不能完全取代传统鉴定方法。

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