应用反向线点杂交技术鉴定临床常见曲霉属和毛霉目真菌

赵作涛 李丽丽 王晓阳 万喆 陈伟 李若瑜

(北京大学第一医院皮肤性病科，北京大学真菌和真菌病研究中心，北京 100034)

近年来，随着广谱抗生素、抗肿瘤药物、糖皮质类固醇激素和免疫抑制剂在临床上的广泛应用，器官移植及导管技术的活跃开展，艾滋病和糖尿病的发病率的上升，免疫受损患者不断增多，曲霉属和毛霉目真菌感染的发病率呈急剧上升趋势，是免疫受损患者，特别是造血干细胞移植、器官移植及肿瘤放化疗患者的主要致死因素之一［1-2］。曲霉现已成为我国仅次于念珠菌的第二位条件致病性真菌，其感染死亡率高，如免疫受损患者发生侵袭性曲霉感染的病死率可高达90%;而毛霉目真菌的感染近年来也有不断增多趋势，特别在重症糖尿病和器官移植患者发生的急进性感染常可迅速危及患者生命［3-4］。曲霉属和毛霉目真菌的临床表现比较相似，但两者对不同抗真菌药物敏感性不尽相同，治疗与预后也不同。因此，正确鉴别真菌的种类是提高治愈率的关键。然而，传统的真菌病原体诊断方法存在耗时久、敏感性和特异性低的缺陷，远远不能满足临床早期特异诊断的需要。本研究使用靶向真菌的保守序列18S和28S rDNA区域的真菌通用引物，应用PCR方法进行扩增，再根据具有种特异性序列特征的ITS1区和ITS2区域设计具有种特异性的探针对PCR扩增产物进行反向线点杂交，拟鉴定曲霉属和毛霉目真菌至种的水平［5-6］。并与传统形态学鉴定方法、ITS区DNA测序方法鉴定结果比较，验证RLB方法的敏感性和特异性，拟为临床快速鉴定和早期诊断曲霉属和毛霉目真菌提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

实验菌株 收集我院真菌与真菌病研究中心保藏的98株临床分离菌株，其中包括烟曲霉15株、黄曲霉12株、黑曲霉11株、土曲霉15株、构巢曲霉菌4株、冻土毛霉菌11株、总状毛霉菌4株、卷曲毛霉菌5株、少根根霉5株、小孢根霉10株、微小根毛霉2株、伞状犁头霉4株，以及8株实验对照菌株，分别为白念珠菌、茄病镰刀菌、尖端赛多孢菌、马尔尼菲青霉、疣状瓶霉、棒曲霉、日本曲霉以及雅致小克银汉霉各1株(见表1)。

试剂 EDAC，Sigma公司;Biodyne C尼龙膜，Pall公司;链亲和素-过氧化物酶，Roche公司;化学发光增强剂(ECL)，Roche公司;X线片，Amersham公司。

表1 98株实验菌株的和8株对照菌株的传统形态学鉴定，ITS区序列分析与RLB鉴定结果Tab.1 Ninety-eight well-characterized fungal strains and 8 control stains identified by the conventional morphological methods，ITS senquence analysis and RLB assay

主要实验仪器 PCR仪，Perkin-Elmer 9600 Thermal Cycler，Eppendorf公司;Miniblotter，Immunetic公司;杂交箱，Thermo公司;暗盒，Amersham公司;测序仪，ABI PRISM 373 DNA sequencer;Labculture超净工作台，Esco公司;Incubator生化培养箱，Sanyo公司;台式高速离心机，TGL-16G上海医用分析仪器厂;琼脂糖凝胶电泳仪，Mupid，Advance公司;凝胶成像仪，BIORAD公司。

1.2 方法

引物、探针的选择与设计 引物和探针序列见表2。本研究使用的引物为真菌通用引物:ITS1和ITS4，长度为19～20 bp，退火温度在55.75～61.88℃，扩增片段大小在 600 ～700 bp。PCR的引物5＇末端使用生物素标记，以便通过链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶底物结合来检测。使用的探针为种特异性探针，为了能够在一致的体系条件下杂交，探针设计成具有相似的物理特性;长度在 20～29 bp，退火温度为 54.48～63.68℃ (见表2);使用Genbank中的序列进行比对。所有的探针5＇末端用胺标记以和尼龙膜共价键的结合，使探针在尼龙膜上条带状排列并且可以重复使用尼龙膜。

表2 本研究使用的引物和探针Tab.2 Oligonucleotide primers and probes used in this study

探针 AFUM、ANIG、ATER、ANID 引用文献，AFLU在文献所给探针的基础上有所改造［7-8］;探针 MHEI、MRAC、MCIR、RAPP、RMIC、RPUS、ACOR由本课题研究者设计，设计方法为:首先在NCBI上查找出所用的12株真菌的核糖体DNA序列(包括18S部分区域、ITS1区、5.8S、ITS2区和28S部分区域)，利用序列对比软件DNAMEN对真菌的rDNA序列进行对比，在ITS1或ITS2区找出每种真菌特异性序列，再引物设计软件Primer 5和Oligo 6对该段特异性序列进行检测，确保所设计的探针不形成发夹结构。

所有引物5＇端生物素标记、探针5＇末端用胺标记、引物和探针合成及标记均由Sangon公司完成。

探针标记 为了优化杂交的条件，我们在前期工作基础上将探针以0.6 μmol/L为起始浓度进行倍比稀释，选定的最适终浓度为0.6 pmol/L，标膜的具体步骤见参考文献［5-9］。

真菌DNA提取 我们在前期工作基础上，对氯化苄法进行改良，具体操作详见参考文献［10-11］。

PCR反应体系 PCR反应总体积为25 μL，含模板 DNA 1 μL，10 × Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.25 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，引物 50 pmol/L 各 0.5 μL，Taq 酶 (5 U/μL)0.1 μL，补超纯水至 25 μL。

PCR反应条件 95℃ 15 min，扩增变性、退火、延伸的条件分别为94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。取8 μL PCR产物于1.5%的琼脂糖中电泳30 min后染色30 min，于凝胶成像系统照相，剩余的PCR产物用于RLB杂交。

杂交 RLB杂交的方法基于文献报道及前期工作方法改良而成，具体步骤见参考文献［5-9］。RLB的结果的判定标准为:标记有种特异性探针对应的底片位置上，出现黑点，表示结果为阳性。无黑点，表示结果为阴性。

RLB敏感性检测 通过烟曲霉基因组DNA浓度10倍倍比稀释法进行稀释，将获得的不同浓度的DNA进行PCR扩增，继之行RLB杂交，可以见到RLB杂交信号的最低浓度即为RLB的敏感性。

3种鉴定方法的比较 通过RLB杂交方法鉴定结果与传统形态学鉴定方法，ITS区测序方法结果进行比较，进一步评价该方法的敏感性和特异性。

2 结 果

2.1 真菌培养及形态学鉴定

将实验所用的临床分离菌株标本转种培养后，观察菌落的形态和颜色，并在镜下观察真菌分生孢子头或孢子囊的形态、菌丝横径、分枝、有无横隔，可以对真菌进行初步形态学鉴定，见表1。

2.2 PCR产物凝胶电泳结果

98株实验菌株均能用真菌通用引物扩增出相应的条带，目的片段与预期一致，600～700 bp大小(见图1)。

2.3 DNA 测序结果

98株菌临床分离株得到良好的测序结果，与GenBank和CBS的菌种基因序列库比对后，得到相应的比对结果(见表1)。

2.4 RLB 结果

本研究选取的98株实验菌株中，均能够通过利用自主设计的种特异性探针检测出结果，相互之间并无交叉反应(见图2)。本研究所用的98株临床分离株RLB结果见表1。对于98株临床分离株，RLB鉴定结果与传统真菌鉴定方法 (真菌培养及镜检)、DNA测序结果完全一致。8株对照菌株，分别为白念珠菌，茄病镰刀菌，尖端赛多孢菌，马尔尼菲青霉，疣状瓶霉，棒曲霉，日本曲霉以及雅致小克银汉霉均未不能为RLB方法鉴定。

2.5 RLB敏感性检测结果

通过烟曲霉基因组DNA浓度10倍倍比稀释法，RLB可以检测的最低基因组DNA浓度为1.8×10-3ng/μL(见图3)。

3 讨 论

早期诊断并开展针对性的治疗可以降低真菌感染的病死率，是提高治愈率的关键。但是，对于曲霉和毛霉目真菌感染，传统的病原体诊断方法存在耗时久、敏感性和特异性低的缺陷，远远不能满足临床早期特异诊断的需要。如直接镜检法可见到菌丝，但曲霉和毛霉目真菌形态相似，阴性结果亦不能排除诊断。传统的真菌培养法可以确定真菌的种类，但耗时长，阳性率较低。病理学检查在组织中查到真菌是疾病诊断的“金标准”，但是组织病理学检查常常无特异性，不能将真菌鉴定到种的水平。而免疫组化及原位杂交技术目前也仅限于少数种类真菌的诊断及鉴定，这就限制了该两项技术的临床应用。因此，建立一种快速、敏感且可以同时鉴定多种临床常见曲霉和毛霉目真菌的方法十分必要。

分子生物学技术的飞速发展，广泛应用于病原真菌的分型、鉴定和亲缘关系研究，为早日解决真菌感染的早期、特异诊断这一难题提供了良机［12］。PCR相关技术因具有敏感性高，特异性好，快速、便捷的优势，是目前最常用的分子生物学诊断手段，这些技术包括利用 PCR［13］、巢氏 PCR［14］、多重PCR［15］、Real time PCR［16］、限制性片段长度多态性分析［17］、RAPD［18］、ITS 区直接测序［19］、芯片技术等［20］。但是，鉴于致病真菌的物种多样性，这些技术都有其自身局限性，例如，1次1种引物PCR扩增不可能检测多种真菌感染，多重PCR扩增由于常见菌种的扩增片段大小较为接近，单纯通过凝胶电泳常常无法鉴定;限制性片段长度多态性分析，1种酶切有时无法鉴别多种菌种，多种酶切，片段类型复杂，费时费力;探针杂交技术相对简单可行，但是目前在念珠菌感染方面研究较多，鉴定真菌种类较少，且每次只能鉴定一种真菌，这些方法都无法满足临床快速一次高通量诊断的需要，无法同时检测多种临床常见的重要的真菌;而序列分析和芯片技术由于耗时较长、费用较高，均未广泛应用于临床诊断［12-20］。

文献证实RLB技术可以检测和鉴定临床重要致病菌，包括细菌、病毒、寄生虫和真菌［7-11］。与其他分子生物学方法相比，RLB方法具有很多优点:易于操作，不需要使用凝胶电泳，具有费用低和省时的优点;RLB方法使用序列种特异性探针来鉴定PCR产物，增加了检测的敏感性(通过杂交以及显色的信号放大)和特异性;只需1次PCR和1张膜即可以同时鉴定43株菌株，并且可以在1个工作日内完成;标记的膜可以重复使用50次以上均无明显的信号丢失;MiniBlotter仪可以标记45道探针，所以还可以同时检测以上所有临床常见的致病真菌，并可加入其他靶基因，例如其他新发现的重要真菌种类，并且可以根据研究需要进行任意组合。尤其值得强调的是，RLB技术可以为真菌培养呈阴性结果及真菌混合感染的病例提供诊断。此外，RLB技术在早期诊断方面具有潜在的优势，尤其对于真菌培养需时长、病理诊断难以确定真菌的种类，RLB仅需1个工作日，包括DNA的提取 (大约3 h)、PCR(大约2 h)及用RLB技术检测PCR产物(大约3 h)。而对于临床样本，我们通过用扩增较小片段的引物 (ITS1和ITS2、ITS3和ITS4)来缩短PCR循环时间，可以临床早期诊断真菌感染。

图1 12种真菌ITS区PCR扩增结果:1～12.12种菌的PCR结果 (分别为烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉、冻土毛霉菌、总状毛霉菌、卷枝毛霉菌、少根根霉、小孢根霉、微小根毛霉、伞状犁头霉);M.100 bp ladder marker 图2 反向线点杂交结果:1～12.12种菌的RLB结果 (分别为烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉、冻土毛霉菌、总状毛霉菌、卷枝毛霉菌、少根根霉、小孢根霉、微小根毛霉、伞状犁头霉)。12种探针标记的顺序与表2所列一致，每种探针标记2道代表不同的探针浓度 (0.2 pmol/L和0.4 pmol/L)。12种真菌的PCR产物与相应的种特异性探针杂交，未与其余探针结合 图3 RLB敏感性检测结果:通过烟曲霉基因组DNA浓度10倍倍比稀释法，PCR/RLB 可以检测的最低基因组 DNA 浓度为1.8 ×10-3ng/μL(1.阴性对照，2.1.8 ng/μL，3.1.8 ×10-1ng/μL，4.1.8 ×10-2ng/μL，5.1.8 ×10-3 ng/μL，6.1.8 ×10-4ng/μL，7.1.8 ×10-5ng/μL，8.1.8 ×10-6ng/μL)Fig.1 Results of PCR assay for 12 strains(Lanes 1 to 12 represent the 12 strains in the following order:A.fumigatus，A.flavus，A.niger，A.terreus，A.nidulans，M.heimalis，M.racemosus，M.cercinelloidea，R.arrhizus，R.microsporus，R.pusillus，A.corymbifera;M.100 bp ladder marker) Fig.2 Results of PCR-based reverse line blot hybridization assay(PCR/RLB)hybridization for 12 strains(Lanes 1 to 12 represent the 12 strains in the following order:A.fumigatus，A.flavus，A.niger，A.terreus，A.nidulans，M.heimalis，M.racemosus，M.cercinelloidea，R.arrhizus，R.microsporus，R.pusillus，A.corymbifera).The 12 labeled probes are in the same order as in Tab.2 Duplicate rows for the same probe represent different concentrations(0.2 pmol/L and 0.4 pmol/L).PCR products for the 12 strains were hybridized with the species-specific probes，but not any other probes Fig.3Analytical sensitivity of PCR/RLB assay.The analytical sensitivity of PCR/RLB assay was 1.8 ×10-3ng/μL by 10-fold serial dilution of Aspergillus fumigatus genomic DNA(1.Negative control，2.1.8 ng/μL，3.1.8 ×10-1ng/μL，4.1.8 ×10-2ng/μL，5.1.8 ×10-3ng/μL，6.1.8 ×10-4ng/μL，7.1.8 ×10-5ng/μL，8.1.8 ×10-6ng/μL)

Zeng和Playford等应用RLB技术来检测一些临床常见的念珠菌、曲霉菌和隐球菌［7-8］。但是遗憾的是他们的研究没有涵括毛霉目真菌，而毛霉目真菌的感染发病率增加，特别在重症糖尿病和器官移植患者发生的急进性感染死亡率高，具有重要的临床意义［3-4］。但是曲霉属和毛霉目真菌，二者形态学近似，特别是当病理学检查，真菌成分数量少、菌丝肿胀变形时，仅根据真菌的排列方式和真菌形状难以鉴别二者。

据此，在本研究中，我们利用RLB技术检测12种临床重要的曲霉属和毛霉目真菌，包括5种曲霉属和7种毛霉目真菌。通过对98株临床分离菌株提取真菌的DNA后用RLB技术鉴定，结果显示与真菌形态学鉴定结果、ITS区测序结果相一致，菌种之间没有出现交叉杂交。本研究显示RLB技术检测与传统真菌鉴定方法，DNA测序及病理学检查比较，具有敏感性高 (1.8×10-3ng/μL)，特异性较高(100%)的特点，可以作为流行病学调查的工具及进一步应用于临床标本的快速诊断，具有很好的临床应用前景。

［1］Hagen EA，Stern H，Porter D，et al.High rate of invasive fungal infections following nonmyeloablative allogeneic transplantation［J］.Clin Infect Dis，2003，36(1):9-15.

［2］Nucci M，Spector N，Bueno AP，et al.Risk factors and attributable mortality associated with superinfections in neutropenic patients with cancer［J］.Clin Infect Dis，1997，24(4):575-579.

［3］Nosari AP，Oreste M，Montillo G，et al.Mucormycosis in hematologic malignancies:an emerging fungal infection［J］.Haematologica，2000，85(10):1068-1071.

［4］Ribes JA，CL Vanover-Sams，DJ Baker.Zygomycetes in human disease［J］.Clin Microbiol Rev，2000，13(2):236-301.

［5］Zhao ZT，Kong FR，Gilbert GL.Reverse line blot(RLB)assay for direct identification of sevenStreptococcus agalactiaemajor surface protein antigen genes［J］.Clin Vaccine Immunol，2006，13(1):145-149.

［6］Zhao ZT，Martinez G，Kong FR，et al.Molecular serotype identification ofStreptococcus agalactiaeof bovine origin by multiplex PCR-based reverse line blot(mPCR/RLB)hybridization assay［J］.FEMS Microbiol Lett，2006，263(2):236-239.

［7］Zeng X，Kong FR，Halliday C，et al.Reverse line blot hybridization assay for identification of medically important fungi from culture and clinical specimens［J］.J Clin Microbiol，2007，45(9):2872-2880.

［8］Playford EG，Kong FR，Sun Y，et al.Simultaneous detection and identification ofCandida，Aspergillus，andCryptococcusspecies by reverse line blot hybridization［J］.J Clin Microbiol，2006，44(3):876-880.

［9］Kong FR，Gilbert GL.Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay(mPCR/RLB)-a practical epidemiological and diagnostic tool［J］.Nat Protoc，2006，1(6):2668-2680.

［10］赵作涛，姬黎明，王爱平，等.肝移植后播散性隐球菌病一例:临床及实验室研究［J］.中国真菌学杂志，2008，3(5):268-271.

［11］赵作涛，鲁巧云，高那，等.首次报道中国北方Fonsecaea monophora所致着色芽生菌病1例［J］.中国真菌学杂志，2010，5(4):193-195.

［12］王晓阳，赵作涛，李若瑜.深部念珠菌感染的诊断进展［J］.中国真菌学杂志，2008，3(6):368-371.

［13］Bialek R，Konrad F，Kern J，et al.PCR based identification and discrimination of agents of mucormycosis and aspergillosis in paraffin wax embedded tissue ［J］.J Clin Pathol，2005，58(11):1180-1184.

［14］Rickerts V，Just-Nübling G，Konrad F，et al.Diagnosis of invasive aspergillosis and mucormycosis in immunocompromised patients by seminested PCR assay of tissue samples［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2006，25(1):8-13.

［15］Francesconi A，Kasai M，Harrington SM，et al.Automated and manual methods of DNA extraction forAspergillus fumigatusandRhizopus oryzaeanalyzed by quantitative real-time PCR［J］.J Clin Microbiol，2008，46(6):1978-1984.

［16］Nagao K，Ota T，Tanikawa A，et al.Genetic identification and detection of human pathogenicRhizopusspecies，a major mucormycosis agent，by multiplex PCR based on internal transcribed spacer region of rRNA gene［J］.J Dermatol Sci，2005，39(1):23-31.

［17］Machouart M，Larché J，Burton K ，et al.Genetic identification of the main opportunistic Mucorales by PCR-restriction fragment length polymorphism［J］.J Clin Microbiol，2006，44(3):805-810.

［18］Vastag M，Papp T，Kasza Z，et al.Intraspecific variation in two species ofRhizomucorassessed by random amplified polymorphic DNA analysis［J］.J Basic Microbiol，2000，40(4):269-277.

［19］Leaw SN，Chang HC，Sun HF，et al.Identification of medically important yeast species by sequence analysis of the internal transcribed spacer regions［J］.J Clin Microbol，2006，44(3):693-699.

［20］Leinberger DM，Schumacher U，Autenrieth IB，et al.Development of a DNA microarray for detection and identification of fungal pathogens involved in invasive mycoses［J］.J Clin Microbol，2005，43(10):4943-4953.