加那利海枣叶斑病病原鉴定＊

杨淑荣， 王延丽， 谢昌平， 李超萍， 张科立

（海南大学环境与植物保护学院，儋州 571737）

加那利海枣叶斑病病原鉴定＊

杨淑荣， 王延丽， 谢昌平＊＊， 李超萍， 张科立

（海南大学环境与植物保护学院，儋州 571737）

对加那利海枣叶斑病的症状进行了观察。结果表明，加那利海枣叶斑病主要发生在叶片和叶柄。初期症状是在叶片和叶柄出现水渍状褪绿色的褐色小点，病斑扩大成浅褐色椭圆形或不规则病斑，病斑周围有黄色的晕圈，后期变褐色至灰褐色，中央产生小黑点。按照柯赫氏法则对该病害的病原菌进行分离和致病性测定。通过形态学观察和rDNA-ITS序列分析鉴定，将病原菌鉴定为异色拟盘多毛孢［Pestalotiopsis versicolor（Speg.）Steyaert］。

加那利海枣； 叶斑病； 异色拟盘多毛孢； rDNA-ITS； 鉴定

＊ 致 谢： 在试验过程中，广西大学韦继光教授对病原菌鉴定给予帮助，中国热带农业科学院环境与植物保护研究所黄贵修研究员、时涛助理研究员和刘先宝助理研究员在分子鉴定方面给予大力帮助，谨表衷心感谢！

＊＊ 通信作者 Tel：0898-23306796；E-mail：xiechangping002＠sina.com

加那利海枣（Phoenix canariensis）属棕榈科，刺葵属，别名长叶刺葵、针葵和槟榔竹等。是一种极具热带风情的观赏棕榈植物，广泛应用于公园造景和行道绿化，也可作室内观赏，是世界著名的高级风景树种之一［1－2］。近年来随着城市绿化，加那利海枣的栽培数量逐渐增加。2006年7－10月，笔者在海南省儋州市南湖公园和中心花圃内的加那利海枣叶片和叶柄上发现一种病害，田间发病率高达85%～90%。目前，国内对加那利海枣叶斑病有关报道较少。罗金水等［3］报道福建省加那利海枣苗圃中发生的褐斑病是由柯氏帚梗柱孢霉（Cylindrocladium colhouniiPeerally）引起的。金亮等［4］报道厦门地区加那利海枣叶斑病由掌状拟盘多毛孢（Pestalotiopsis palmarumCooke.）引起，但仅危害叶片，不危害叶柄，且病原菌的鉴定仅通过形态学鉴定。笔者通过形态学观察发现，加那利海枣叶斑病菌与金亮等［4］的掌状拟盘多毛孢有较大的差异。张家祥和葛起新等详细报道在加那利海枣上分离出拟盘多毛孢属（Pestalotiopsisspp.）真菌，分别为异色拟盘多毛孢［P.versicolor（Speg.）Steyaert］和韦司梅拟盘多毛孢［P.vismiae（Petr.）Zhang et Xu Comb.nov.］，并对病原菌的孢子形态和大小及培养性状作了描述［5－6］。为了明确引起加那利海枣叶斑病的病原，笔者对海南省儋州市加那利海枣叶斑病的病原菌进行了分离和鉴定。

1 材料和方法

1.1 材料来源

材料采自海南省儋州市南湖公园内的加那利海枣上发病典型的叶片和叶柄。

1.2 症状描述

按常规方法对田间病株出现的症状进行描述，并拍摄病害的症状。

1.3 菌株的分离与纯化

采用常规组织分离方法［7］，从发病部位的病健交界处切取大小约4～5mm的组织块，用70%乙醇消毒数秒后，用0.1%升汞表面消毒1min，无菌水冲洗3次，放置在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，观察分离菌的生长和产孢情况，将叶片和叶柄上分离所得的病原菌分别标记为P1和P2菌株。采用琼脂平板稀释纯化法进行纯化［7］。

1.4 菌株的致病性测定

将纯化、产孢的病原菌P1、P2菌株用无菌水配制成50～60个分生孢子（10×20倍）的孢子悬浮液，田间喷洒在同一品种健康寄主植株的叶片和叶柄上，以无菌水作为对照；接种后保湿，观察并记录发病情况。

1.5 病原菌形态观察

将纯化的菌株分别接种在PDA培养基上，培养5d后，观察菌落颜色、形状、大小及产孢情况，后挑取病原菌，制临时玻片，镜检并观察分生孢子的颜色、形态和大小。

1.6 病原菌核糖体DNA-ITS序列的PCR扩增和分析

1.6.1 基因组DNA的提取

采用 CTAB提取总 DNA［8］。

1.6.2 病原菌核糖体DNA-ITS序列扩增

（1）通用引物：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。由上海英骏生物技术有限公司合成。

（2）PCR反应体系：ddH2O 19μL；10×Buffer 2.5μL；dNTP（2.5mmol／L）0.7μL；ITS1（10pmol／L）1μL；ITS4（10pmol／L）1μL；TaqDNA聚合酶（2.5U／μL）0.3μL；模板 DNA（0.5ng／μL）0.5μL。总体积25μL。PCR反应参数为：94℃预变性3min；94℃变性50s；60℃退火1min；72℃延伸1min；35个循环；72℃延伸完全10min。反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6.3 病原菌核糖体DNA-ITS序列同源性比较

对测得的供试菌株核糖体DNA-ITS区段的序列，分别运用GenBank核酸数据库中的BLAST工具软件，在DNA序列数据库中搜索同源DNA序列并进行比较分析，根据BLAST搜索和比较的结果，进行同源性分析。

2 结果与分析

2.1 症状

叶斑病主要危害叶片和叶柄。发病初期在叶片上出现水渍状褪绿色的褐色小点，病斑扩展成浅褐色椭圆形或不规则形小斑，病斑大小为1～3mm，病斑周围有黄色的晕圈；随病斑的进一步扩大，病斑周围出现轮纹，多个病斑愈合成不规则形的大斑，病斑中央呈黑褐色，边缘颜色成深褐色，在病斑中央散生许多小黑点，发病严重时整叶干枯（图1a）。

叶柄上发病多从带刺部位先发病，初期在植株叶柄上出现水渍的褐色小斑点，中期小斑点变为红褐色至黑褐色长条形病斑，并且不断地扩大，后期几个病斑扩大连成一片，形成大病斑，病部表皮皱缩，中央凹陷，严重时造成整个叶柄干枯（图1b）。

2.2 病原菌的致病性

接种15d后，用孢子悬浮液接种的叶片和叶柄均发病，所产生的症状与田间自然发病的症状相同，并从接种发病的病斑上重新分离到相同的病原菌。而对照叶片和叶柄均不发病（图1c）。

2.3 病原菌的形态

该病原菌在PDA培养基上生长迅速，菌落圆形，边缘不平滑，菌丝白色絮状，孢子堆颜色呈墨汁色，排列比较稀疏，菌丝层分布均匀，无轮纹；背面具淡橘黄色的色素；在28℃的光照条件下有分布不均匀的黑色斑点，无明显轮纹，10d后在菌落表明产生黑色的分生孢子堆（图1d）。分生孢子长梭形，有的稍微弯曲，4隔5胞，分生孢子大小为：（21.1～32.0）（27.0）μm×（6.5～11.2）（8.6）μm；中间3个细胞着色，上二色孢褐色至暗褐色，第三色胞颜色较浅，淡褐色，分隔处颜色加深；色胞长（13.8～19.5）（16.9）μm；顶和尾孢均为三角形，无色透明，顶胞上着生无色附属丝2～3根，长（10.4～26.0）（16.2）μm，尾孢上着生一根基部附属丝，中生，长（3.9～9.1）（5.2）μm（图1e）。分生孢子从第3个有色胞萌发，首先第三色胞膨大变圆形，颜色变浅，后从其一边或两边同时萌发出芽管，芽管慢慢伸长变成根状的细管，随着芽管的伸长第三色胞逐渐收缩，整个细胞也会渐渐收缩（图1f）。根据形态特点，查阅相关资料［5－6，9－10］初步 确定该 病 原 菌 为 有 丝 分 裂 孢 子 真 菌的腔孢纲（Coelomycetes）、黑盘孢目（Melanconia-les）、拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）、异色拟盘多毛孢［P.versicolor（Speg.）Steyaert］。

2.4 病原菌的rDNA-ITS分子鉴定

将扩增片段经克隆和测序的rDNA-ITS序列在NCBI进行BLAST比对，结果显示：病原菌目的片段序列与数据库中已有的异色拟盘多毛孢（P.versicolor）rDNA-ITS核苷酸序列（登录号为AF405298）相似性达99%。结合形态学特征和rDNA-ITS序列对比分析，确定引起加那利海枣叶斑病的病原菌为异色拟盘多毛孢菌［P.versicolor（Speg.）Stey.］。

3 讨论

对拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）种的鉴定，传统的方法是采用寄主范围、培养性状和病原菌的形态学进行。由于拟盘多毛孢菌的寄主范围非常广，因此，根据寄主范围来确定种是不准确的。培养性状在不同转代间稳定性较差，但属内不同种之间差异确实存在，菌落形态颜色、菌落背面色素沉淀情况、背面轮纹的有无等在种间鉴定方面具有一定的参考价值。而病原菌形态学在鉴定中极为重要，特别是分生孢子顶端附属丝的端部是否匙状膨大是重要的形态特征，它能够较稳定地遗传，并且在光学显微镜下比较明显，因此，对该菌种鉴定有较大的参考作用。但对于多数拟盘多毛孢菌由于没有匙状膨大这一重要形态特征，并且各菌种间差异往往不明显，所以仅凭形态学有时也难以确定种。由于rDNA-ITS区域种间存在着丰富的变异，而在种内不同菌株间却具高度保守性，常用于鉴定种和种内新株系［11－12］。本研究结合病原菌培养性状、形态学特征和rDNA-ITS序列分析，确定加那利海枣叶斑病菌为异色拟盘多毛孢菌［P.versicolor（Speg.）Steyaert］。

［1］ 刘海桑.观赏棕榈［M］.北京：中国林业出版社，2002：276.

［2］ 林有润.观赏棕榈［M］.哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，2003：59.

［3］ 罗金水，王美盛，林秀香，等.加那利海枣褐斑病的病原菌鉴定［J］.热带作物学报，2009，30（1）：104-107.

［4］ 金亮，丁印龙.厦门地区主要棕榈植物病害种类普查鉴定及其防治［J］.热带农业科学，2000，86（4）：12-19.

［5］ 张家祥.中国南方拟盘多毛孢属真菌及其分种性状的研究［D］.杭州：浙江大学，2002：29-30.

［6］ 葛起新，陈育新，徐同.中国真菌志（第三十八卷：拟盘多毛孢属）［M］.北京：科学出版社，2009：195-198.

［7］ 方中达.植病研究方法［M］.第3版.北京：中国农业出版社，1998：137-138，195-198.

［8］ 陈德富，陈喜文.现代分子生物学实验原理与技术［M］.第1版.北京：科学出版社，2006：100.

［9］ 韦继光，徐同，潘秀湖，等.拟盘多毛孢属的分类学研究进展［J］.广西农业生物科学，2006，25（1）：81.

［10］韦继光，徐同，郭良栋，等.根据形态学和分子系统学特征界定拟盘多毛孢属的种［J］.广西农业生物科学，2005，24（3）：311.

［11］张志华，洪葵.核酸序列直接分析在菌物鉴定方面的应用［J］.华南热带农业大学学报，2006，12（2）：39.

［12］刘春来，文景芝，杨明秀.rDNA-ITS在植物病原菌物分子检测中的应用［J］.东北农业大学学报，2007，38（1）：101.

Identification of the pathogen causing the leaf spot disease ofPhoenixcanariensis

Yang Shurong， Wang Yanli， Xie Changping， Li Chaoping， Zhang Keli
（1.College of Environmental and Plant Protection，Hainan University，Danzhou571737，China）

The symptoms of leaf spot ofPhoenix canariensiswere observed.The results showed that leaf spot ofP.canariensismainly occurred on leaves and petioles.The early symptom was brown lesion with water soaked and chlorotic leaves and petioles.Lesion expanded into brownish oval or irregular spots.The spots were surrounded by yellow helos and the spots changed into brown to grayish brown during the late stage.Centres of the spots produced black dots.According to Koch’postulates，the pathogens were isolated and pathogenicity was determined.Based on morphological characters and sequence of rDNA-ITS，the pathogen was identified asPestalotiopsis versicolor（Speg.）Steyaert.

Phoenix canariensis； leaf spot；Pestalotiopsis versicolor； rDNA-ITS； identification

S 436.8

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.05.027

2010-09-28

2010-12-02

海南省科技基金项目（No.Rnd0524）