RNAi在植物寄生线虫功能基因组研究中的应用

龙 海, 李芳荣, 李一农*, 仲建忠

(1.深圳出入境检验检疫局,深圳 518001; 2.深圳市检验检疫科学研究院,深圳 518045)

RNAi在植物寄生线虫功能基因组研究中的应用

龙 海1,2, 李芳荣1, 李一农1*, 仲建忠1

(1.深圳出入境检验检疫局,深圳 518001; 2.深圳市检验检疫科学研究院,深圳 518045)

最近,南方根结线虫(Meloidogyne incognita)和北方根结线虫(M.hapla)的基因组测序工作已经完成,而大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)和马铃薯白线虫(Globodera pallida)的基因组测序工作也在进行之中。截至2008年,Nematode.net数据库中已经有近500 000个表达序列标签ESTs序列和1 200 000个来自30种线虫的基因组序列。如何从众多的序列中筛选出有实际应用价值的信息是线虫学研究面临的一大挑战。对于缺乏有效转化系统的植物寄生线虫来说,RNAi无疑是研究植物寄生线虫基因功能的有力工具。本文介绍了RNAi及其在植物寄生线虫基因功能研究中的应用。

植物寄生线虫; 基因组; ESTs; 转化系统; RNAi

全球的农业生产每年因植物寄生线虫造成的损失约为1 250亿美元[1]。由于抗线虫基因活性的丧失,高毒化学农药的禁用和生物防治方法的局限性,发展新的线虫防控策略迫在眉睫。目前,科学家正在对线虫的ESTs和基因组进行研究分析,期望找到防控线虫的新靶标,而RNAi在其中发挥了重要作用。

1 外源性RNAi的机制

RNA干扰(RNAi)是一种细胞机制,由双链RNA(dsRNA)驱动序列同源基因的转录后沉默。外源dsRNA触发的RNAi先由主细胞群,一般是肠上皮细胞摄取外源dsRNA,接着基因沉默向较远的细胞或组织做系统性传播。在秀丽小杆线虫(Caenorhabditiselegans)中,dsRNA结合蛋白RDE-4和RNaseIII-相关酶Dicer与dsRNA结合,并将其加工成21～25个核苷酸长的初级短干扰RNA(short interfering RNAs,siRNAs)。DCR-1、RDE-4、RDE-1 和初级siRNAs一起形成RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex,RISC)。RISC利用siRNAs寻找靶mRNA,将其切割或者抑制它们翻译[2]。在植物和秀丽小杆线虫中,RNAi的高效性有赖于RNA的扩增[3]。在秀丽小杆线虫中,初级siRNAs指导依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerases,RdRP)以同源mRNA作为模板,用一种不依赖Dicer的方式合成次级 siRNAs,其 5′端是三磷酸,比初级siRNAs的量大,能更有效地触发转录后沉默[4]。

2 植物寄生线虫的体外RNAi

通过微注射或者饲喂秀丽小杆线虫大肠杆菌,可以将dsRNA导入秀丽小杆线虫。但是对于植物寄生线虫却难以实现。植物寄生线虫的RNAi一般通过浸泡实现。自从首次将RNAi用于大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)和南方根结线虫(Meloidogyne incognita)以来,已经报道了 20余例 RNAi在植物寄生线虫上的应用[5]。对于静止的植物寄生线虫,卵和2龄幼虫J2是非寄生阶段,可用于浸泡。将甘蓝根结线虫(M.artiellia)的卵浸泡在几丁质合成酶的dsRNA溶液中,引起几丁质酶转录物的缺失,几丁质的合成减少和幼虫的孵化延迟,这说明dsRNA能透过卵的胶状基质和几丁质层进入线虫体内[6]。将马铃薯白线虫(Globodera pallida)的J2浸泡在FMRF酰胺类多肽基因(FMRFamide-like peptide,f lp)的dsRNA中,结果J2的f lp转录物减少,线虫运动方式发生改变[7]。马铃薯白线虫的f lp对RNAi特别敏感,dsRNA的浓度为 10-9～10-4μ g/μ L就足以触发f lp基因沉默[7]。

很多情况下,将植物寄生线虫J2只是浸泡在dsRNA溶液中并不足以产生 RANi。为了促进南方根结线虫摄取dsRNA,用脂质体或胶原酶对其进行处理,结果并没有产生RNAi[8]。但是将松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的J2和J3浸泡在含有脂质体的dsRNA溶液中,靶基因的转录物会减少25%～45%[9]。使用神经兴奋剂能刺激线虫摄取dsRNA。章胺和羟色胺调节M3神经元的活动,当秀丽小杆线虫取食时,M3神经元控制咽的收缩。将孢囊线虫浸泡在含有章胺的 dsRNA溶液中,章胺会刺激线虫吸收dsRNA,结果在多个组织中表达的基因发生沉默,包括小肠、皮下组织、精子、雌虫生殖系统、侧器和食道腺[10-11]。将根结线虫的J2浸泡在含有间苯二酚、章胺或者间苯二酚加羟色胺的dsRNA溶液中,也会使在线虫小肠和食道腺中表达的部分基因沉默。同一种根结线虫的不同群体对神经兴奋剂的反应不同,所以神经兴奋剂在刺激根结线虫J2摄取溶质时不是必须的[5]。

线虫浸泡在dsRNA中以后,转录物枯竭的时间决定于靶基因的转录水平和转录物的代谢速度。在南方根结线虫亚腹食道腺中表达的3个基因,GST、钙网蛋白基因和多聚半乳糖基因分别在浸泡后1、16 h和44 h开始有效沉默,说明在一种细胞中,不同的基因开始沉默的时间不同[8,12]。线虫浸泡之后转录物的枯竭只是暂时的,在大豆孢囊线虫中,亚腹食道腺的纤维素酶转录物在浸泡后6～10 d开始恢复[13]。在南方根结线虫中,GST、钙网蛋白基因和多聚半乳糖基因的转录物在浸泡后2～3 d开始恢复[8,12]。

为了测试大豆孢囊线虫背食道腺中表达的两个基因能否同时发生沉默,Bakhetia等[14]将J2浸泡在靶dsRNA的混合溶液中,但是并没有观察到组合沉默的叠加效益表型,可能是因为dsRNAs之间或者siRNAs之间存在竞争。

雄性特异性基因msp在J2中沉默以后,其转录物在线虫以后的发育阶段中也会缺失。说明J2经过处理后,RNAi会持续几天[15]。靶基因Cg-1编码无毒因子,在线虫中表达会使线虫对带有Mi抗性基因的番茄表现出抗性。用Cg-1的特异性dsRNA处理爪哇根结线虫(M.javanica)J2,其中约10%的J2不会诱导Mi抗性番茄产生过敏反应(hypersensitive reaction,HR),并且能在抗性植株上正常繁殖[16]。线虫如果在抗性植株上生长,至少在5代以内,这种表型是保守的而且显性会不断增强。线虫如果在感病植株上生长,这种表型的显性会降低[16]。

3 植物介导的RNAi

通过浸泡诱导RNAi的持续时间较短,解决这一问题的策略是由寄主向寄生阶段的线虫提供dsRNA。dsRNA在线虫的取食位点产生,当线虫取食时,dsRNA被摄取。植物介导的RNAi避免了人工刺激线虫并且源源不断地提供靶dsRNA。可以利用转化植物实现植物介导RNAi,该转化植物的线虫取食位点能够产生发卡状的 dsRNA。发卡RNA自身互补,含有正义和反义克隆长40～800个核苷酸的编码区,两者由100～700个核苷酸长的非编码区隔开。编码区和线虫的靶基因对应,并且和寄主的任何编码序列都不匹配,避免产生脱靶效应。使用这一方法,已经使根结线虫和孢囊线虫食道腺中表达的3个持家基因和5个寄生基因发生了沉默。被稳定转化的植物产生发卡RNA,当线虫取食这些植株时就可以观察到线虫靶转录物的缺失。用线虫的寄生基因16D10的dsRNA转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),再接种根结线虫,线虫取食后,根结的数量减少了63%～90%[17]。甜菜孢囊线虫(Heterodera schachtii)取食转基因拟南芥也会降低靶转录物的量[18]。一种剪接因子和整合酶基因作为RNAi的靶基因,它们的直系同源物在秀丽小杆线虫中的沉默会引发秀丽小杆线虫产生强烈致死表型,植物介导的这两个靶基因在南方根结线虫中沉默后,导致取食线虫的败育[19]。用两种不同的启动子构建载体转化植物,比较它们引起基因沉默的效果,发现要触发线虫的基因沉默,取食位点细胞产生的发卡RNA要达到一定的阈值水平[20]。目前成功的RNAi使用的都是强启动子,如花椰菜花叶病毒CAMV的35S启动子和拟南芥的ACT2启动子。植物介导的RNAi需要强启动子控制发卡RNA的合成和许多浸泡程序中高浓度的dsRNA相一致。还不清楚参与植物介导的RNAi分子的本质,植物细胞激活自身的RNAi机制对发卡 RNA作出反应,导致发卡RNA的剪切,并在细胞质中积累siRNAs。已经在转化的植物中观察到了全长的发卡RNA和siRNAs[17,20-22]。取食的线虫可能会摄取发卡RNA和siRNAs。孢囊线虫中植物介导的RNAi比在根结线虫中难。目前只有两个研究报道了在孢囊线虫中植物介导的 RNAi[21-22],这可能是因为孢囊线虫从细胞质中吸取营养的取食管比根结线虫的小。

构建转基因植物的另一种方法是在取食细胞中产生衍生自病毒的dsRNA。RNA病毒在植物中系统性传播,它们复制时会介导dsRNA分子的合成。将线虫特异性序列导入病毒载体可以使植物细胞产生靶dsRNA。一般选择烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)做载体,因为它向根部移动,并且在根内复制,而且不会对受侵染的组织造成伤害[23]。TRV可以在甜菜孢囊线虫诱导的合胞体中有效增殖,而且不会影响线虫在根部定殖。将甜菜孢囊线虫的甘油三磷酸脱氢酶GAPDH基因部分序列导入TRV载体能够诱导取食的雌虫产生RNAi[24]。TRV也可以在根结线虫诱导的巨细胞中增殖,南方根结线虫在接种病毒的植物上生长,也会产生基因沉默[5]。

4 参与互作的植物基因的沉默

植物基因的沉默可用来评价寄主基因在植物-线虫互作中的作用。Van de Cappelle等[25]对细胞周期蛋白依赖性激酶CDKA进行了发卡RNA介导的RNAi研究,CDKA在线虫取食细胞中由WRKY23启动子驱动发卡RNA的表达,WRKY23启动子在线虫取食位点高度活化。CDKA的有效沉默中断了线虫取食位点的发育进而抑制了孢囊线虫和根结线虫的发育。

在番茄中,用病毒诱导的基因沉默(VIGS)来鉴定番茄抗线虫的必需基因。利用VIGS下调糖基转移酶基因,使Mi-1抗性番茄恢复了对南方根结线虫的易感性。说明糖基转移酶在Mi-1介导的抗性中是必需的[18]。Mi-1不仅使植株对根结线虫有抗性而且还对马铃薯蚜虫(Macrosiphum euphorbiae)和烟粉虱(Bemisia tabaci)有抗性。参与抗性早期信号传导途径的已知候选基因被 TRV介导的VIGS抑制,再测定植物对线虫和蚜虫的抗性。VIGS的靶基因选定Hsp90-1或者stg1,结果导致Mi-1介导的对线虫和蚜虫抗性减弱,这一结果证明通用组件参与了植物对不同病虫害的早期防卫反应[26]。进一步的研究表明有丝分裂原激活蛋白激酶MAPK及其上游激酶MAPKK,也是Mi-1介导的蚜虫抗性的重要组分[27]。

5 RNAi在线虫基因功能研究中的作用

由于植物寄生线虫缺乏转化系统,而且无法产生和增殖突变系。所以RNAi作为一种重要的工具来分析基因的功能,评价它们作为靶标在发展新的线虫防控策略中的效用。在评价靶基因在某一生物学过程中的作用时,RNAi引起的和线虫寄生、发育或存活力有关的表型是重要的依据。

在寄生线虫中使用RNAi,可能观察不到表型,甚至是已经确定靶转录物缺失,可能是因为被处理线虫群体中RNAi的显性降低,或者靶转录物的丰度没有降到所需的阈值水平。尽管将根结线虫的J2浸泡在dsRNA溶液中能使靶转录物的量减少90%[8],但是只有在很低比例的线虫中能观察到表型[16]。虽然已经确定靶转录物和蛋白质被抑制,但是观察不到相应的表型,可能是由相似基因或相互作用基因的功能冗余造成的。例如,重复的种内同源基因往往部分功能冗余,一个基因沉默不会产生表型。

对于内寄生线虫,很多情况下某一表型和某一基因功能之间的相关性并不是直接的。寄生阶段的线虫包埋在根组织中,很难进行生理分析。另外对于专性寄生线虫的表型释义也很困难。线虫发育依靠寄主提供的营养以及寄主细胞分化为成熟的取食细胞,因此,诱导取食细胞产生一个缺陷就可能导致寄主上寄生线虫数量的减少或者雄虫对雌虫比例的增加。在寄生阶段用于鉴定RNAi表型的手段比较有限。许多表型只能在线虫发育失败时才能观察到。相反,非寄生的卵、1龄和2龄幼虫的表型可以用打分的方式进行评价,这些阶段的线虫很容易收集,对靶转录物或蛋白质的缺失进行定量分析。浸泡在dsRNA溶液中的卵会出现孵化缺陷或幼虫发育缺陷。孵化出的J2可以保存数天,用于筛选线虫的存活力、热敏感性、运动力或根吸附性[7,9]。在侵染早期,对根组织中运动的线虫进行染色可以评估靶基因在J2穿刺寄主或迁移中的作用。

植物介导的RNAi可以对取食的线虫提供持续的RNAi触发,使线虫在整个寄生阶段发生基因沉默。将寄生线虫的发育或寄生所必需的基因作为靶标能够建立防控线虫的新方法。植物在线虫的取食细胞中表达dsRNA或发卡 RNA是培育抗性品种的新选择。植物寄生线虫能够迁移到足够深的土层中逃避农药的毒杀,通过在植物中表达线虫必需基因的靶dsRNA培育出的植株能够吸引线虫并且抑制线虫发育,进而有效降低农田中的线虫群体数量。目前正在利用发卡RNA介导的RNAi培育抗病毒和抗昆虫的植物[28-29]。

线虫门中,对线虫生物学起重要作用的基因都是保守的,其中一些在秀丽小杆线虫中有RNAi表型。研究南方根结线虫的基因组发现了1 083个基因家族,在秀丽小杆线虫中它们的种间同源性基因都有RNAi致死表型[30]。如果没有基因组可用,对EST数据库进行研究也可以鉴定防治线虫的靶基因,利用这种方法从香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)和大豆孢囊线虫中分别鉴定了659和1 508个候选靶基因[31-32]。

线虫建立寄生所必需的基因也可以作为植物介导的RNAi的靶标[17]。这一方法的优点是许多寄生必须的基因都是特异性的。另外,对取食细胞形成起关键作用的植物基因发生沉默也可以有效降低线虫的群体数量[25,33]。但是要求严格控制靶dsRNA的表达,避免对植物发育造成伤害;还要求对线虫反应高度特异的启动子,这样的启动子可能存在于对线虫的侵染进行上调的基因中[33]。

6 结语

植物寄生线虫的基因组信息越来越多,需要新技术,如比较基因组学和功能基因组学,从中筛选有价值的信息。目前正在研究线虫寄生的进化和关键的生物学过程,包括如何适应寄生生活。RNAi虽然有局限性,但是有助于分析功能缺陷表型,是功能基因组学的一大突破,特别是对缺乏有效转化系统的线虫来说更是如此。RNAi有助于研究线虫寄生的关键因子,为鉴定新的靶标,建立新的线虫防控方法提供了可能。但是不同的属之间,RNAi的效率不同。目前,利用转基因植物介导的RNAi防控根结线虫比防控孢囊线虫更成功。对植物寄生线虫RNAi机制的研究有助于提高 RNAi的效率,进行大规模RNAi表型试验。利用多种方法确定基因功能,例如基因沉默,基因表达图谱,蛋白质活性,鉴定线虫泌出蛋白的植物配体等更有利于从线虫基因组中寻找有实际应用价值的信息。

[1]Chitwood D J.Research on plant-parasitic nematode biology conducted by the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service[J].Pest Management Science,2003,59:748-753.

[2]Tabara H,Yigit E,Siomi H,et al.The dsRNA binding protein RDE-4 interacts with RDE-1,DCR-1,and a DExH-Box helicase to direct RNAi inC.elegans[J].Cell,2002,109:861-871.

[3]Aoki K,Moriguchi H,Yoshioka T,et al.In vitroanalyses of the production and activity of secondary small interfering RNAs inC.elegans[J].EMBO J,2007,26:5007-5019.

[4]Sijen T,Steiner F A,Thijssen K L,et al.Secondary siRNA s result from unprimed RNA sy nthesis and form a distinct class[J].Science,2007,315:244-247.

[5]Rosso M N,Jones J T,Abad P.RNAi and functional genomics in plant parasitic nematodes[J].Annual Review of Phytopathology,2009,47:207-232.

[6]Fanelli E,Di Vito M,Jones J T,et al.Analy sis of chitin synthase function in a plant parasitic nematode,Meloidogyne artiellia,using RNAi[J].Gene,2005,349:87-95.

[7]Kimber M J,McKinney S,McMaster S,et al.Flpgene disruption in a parasitic nematode reveals motor dysfunction and unusual neuronal sensitivity to RNA interference[J].The FASEB Journal,2007,21:1233-1243.

[8]Rosso M N,Dubrana M P,Cimbolini N,et al.Application of RNA interferencetoroot-knotnematode genes encoding esophageal gland proteins[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,2005,18:615-620.

[9]Park J,Lee K,Lee S J,et al.The efficiency of RNA interference inBursaphelenchus xy lophilus[J].Molecular Cell,2008,26:81-86.

[10]Bakhetia M,Charlton W,Atkinson H J,et al.RN A interference of dual oxidase in the plant nematodeMeloidogyne incognita[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,2005,18:1099-1106.

[11]Shingles J,Lilley C J,Atkinson H J,et al.Meloidogyne incognita:molecular and biochemical characterization of a cathepsin L cysteine proteinase and the effect on parasitism following RNAi[J].Experimental Parasitology,2007,115:114-120.

[12]Dubreuil G,Magliano M,Deleury E,et al.T ranscriptome analy sis of root-knot nematode functions induced in the early stages ofparasitism[J].New Phytologist,2007,176:426-436.

[13]Bakhetia M,Urwin P E,Atkinson H J.qPCR analysis and RN Ai define phary ngeal gland cell-expressed genes ofHeterodera glycinesrequired for initial interactions with the host[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,2007,20:306-312.

[14]Bakhetia M,U rwin P E,Atkinson H J.Characterization by RN Ai of pioneer genes expressed in the dorsal pharyngeal gland cell ofHeterodera glycinesand the effects of combinatorial RN Ai[J].International Journal for Parasitology,2008,38:1589-1597.

[15]Urwin P E,Lilley C J,Atkinson H J.Ingestion of doublestranded RNA by preparasitic juvenile cyst nematodes leads to RN A interference[J].M olecular Plant-Microbe Interactions,2002,15:747-752.

[16]Gleason C A,Liu Q L,Williamson V M.Silencing a candidate nematode effector gene corresponding to the tomato resistance geneMi-1leads to acquisition of virulence[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,2008,21:576-585.

[17]Huang G,Allen R,Davis EL,et al.Engineering broad rootknot resistance in transgenic plants by RNAi silencing of a conserved and essential root-knot nematode parasitism gene[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103:14302-14306.

[18]Schaff J E,Nielsen D M,Smith C P,et al.Comprehensive transcriptome profiling in tomato reveals a role for glycosy ltransferase inMi-mediated nematode resistance[J].Plant Physiology,2007,144:1079-1092.

[19]Yadav B C,Veluthambi K,Subramaniam K.Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection[J].Molecular and Biochemical Parasitology,2006,148:219-222.

[20]Fairbairn D,Cavallaro A,Bernard M,et al.Host-delivered RNAi:an effective strategy to silence genes in plant parasitic nematodes[J].Planta,2007,226:1525-1533.

[21]Sindhu A S,Maier T R,Mitchum M G,et al.Effective and specific in planta RNAi in cy st nematodes:expression interference of four parasitism genes reduces parasitic success.[J]Journal of Experimental Botany,2009,60:315-324.

[22]Steeves R,Todd T,Essig J,et al.T ransgenic soybeans expressing siRNAs specific to a major sperm protein gene suppressHeterodera glycinesreproduction[J].Functional Plant Biology,2006,33:991-999.

[23]Valentine T,Shaw J,Blok V C,et al.Efficient virus-induced gene silencing in roots using a modified tobacco rattle virus vector[J].Plant Physiology,2004,136:3999-4009.

[24]Valentine T,Randall E,Wy pijewski K,et al.Delivery of macromolecules to plant parasitic nematodes using a tobacco rattle virus vector[J].Plant Biotechnology Journal,2007,5:827-834.

[25]Van de Cappelle E,Plovie E,Kyndt T,et al.AtCDK A;1silencing inArabidopsis thalianareduces reproduction of sedentary plant-parasitic nematodes[J].Plant Biotechnology Journal,2008,6:749-757.

[26]Bhattarai K K,Li Q,Liu Y,et al.T heMi-1-mediated pest resistance requires Hsp90 and Sg t1[J].Plant Physiology,2007,144:312-323.

[27]Li Q,Xie Q G,Smith-Becker J,et al.Mi-1-mediated aphid resistance involves alicylic acid and mitogen-activated protein kinase signaling cascades[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,2006,19:655-664.

[28]Baum J A,Bogaert T,Clinton W,et al.Control of coleopteran insect pests through RNA interference[J].Nature Biotechnology,2007,25:1322-1326.

[29]Shimizu T,Yoshii M,Wei T,et al.Silencing by RNAi of the gene for Pns12,a viroplasm matrix protein ofRice dwar f virus,results in strong resistance of transgenic rice plants to the virus[J].Plant Biotechnology Journal,2009,7:24-32.

[30]Abad P,Gouzy J,Aury J,et al.Plant parasitism in metazoans:insights from theMeloidogyne incognitanematode genome[J].Nature Biotechnology,2008,26:909-915.

[31]Alkharouf N W,Klink V P,Matthews B F.Identification ofHeterodera glycines(soybean cyst nematode[SCN])cDNA sequences with high identity to those ofCaenorhabditiseleganshaving lethal mutant or RNAi phenotypes[J].Ex perimental Parasitology,2007,115:247-258.

[32]Jacob J,Mitreva M,Vanholme B,et al.Exploring the transcriptome of the burrowing nematodeRadopholus similis[J].Molecular Genetics and Genomics,2008,280:1-17.

[33]de Almeida Engler J,Favery B,Engler G,et al.Loss of susceptibility as an alternative for nematode resistance[J].Current Opinion in Biotechnology,2005,16:112-117.

RNA interference(RNAi)and its application to the study of functional genomics in plant parasitic nematodes

Long Hai1,2, Li Fangrong1, Li Yinong1, Zhong Jianzhong1
(1.Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shenzhen518001,China;2.Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine,Shenzhen518045,China)

Recently,the genome sequences ofMeloidogyne incognitaandM.haplahave been published.The sequencing project forHeterodera glycinesandGlobodera pallidais also underway.As of 2008,there has been over 500 000 ESTs and 1.2 million genome sequences from more than 30 nematodes in Nematode.net.Plant nematology is now facing the challenge of developing new technology for screening the practical benefits out of the increasing amounts of genomic information.Given the absence of a transformation system for plant parasitic nematodes,RNAi is likely to be an important tool for the study of functional genomics in phytoparasitic nematode.RNAi and its application to the study of functional genomics in plant parasitic nematodes are introduced in this paper.

phytoparasitic nematode; genomics; ESTs; transformation system; RNAi

S 41-30;S 432.45

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.04.002

2010-07-01

2010-10-14

*通信作者E-mail:ly_yinong@126.com