蛋白质分子量测试方法概述

谭和平，王彧婕，邹 燕，谭福元，徐文平

（中国测试技术研究院，四川 成都 610021）

0 引 言

随着后基因组时代的到来，生命科学进入了蓬勃发展的新阶段，蛋白质及其结构、功能、活性、蛋白质组学等的研究发展非常迅速。作为蛋白质主要特征参数之一的分子量，是确定一种新型蛋白、进行蛋白质的后续研究活动的重要前提。因此，研究蛋白质的分子量测试方法，准确有效地对蛋白质的分子量进行测定，是十分紧迫的工作。

蛋白质分子量的测试方法有很多，有应用最广泛和成熟的凝胶电泳法，以及凝胶色谱法、盐析沉淀法、激光光散射法，特别是近年来技术日益成熟、发展迅速的生物质谱技术（包括电喷雾离子化质谱技术以及基质辅助激光解吸电离质谱技术）等，已成为生命科学领域不可或缺的工具。该文将对凝胶电泳法、高效凝胶过滤色谱-激光光散射联用以及生物质谱技术进行简要的介绍。

1 凝胶电泳法

凝胶电泳是根据分子物理性质（如电荷、大小、形状）的不同而实现分离的一类分析技术，它分为聚丙烯酰胺凝胶电泳法、毛细管凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法等。聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）是蛋白质分子量测试中应用最广泛的一类传统方法，蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷及分子大小和形状等因素。在聚丙烯酰胺系统中加入十二烷基硫酸钠（SDS）作为变性剂和助溶剂，大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，形成带相同密度负电荷的复合物。它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关。因此，可根据电泳迁移率求得其相对分子量。Cohen等[1]采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和测试蛋白质和多肽的分子量。在该研究中，肌红蛋白碎片和蛋白质标准物质混合物被证明能够通过20 cm长、有40000个理论塔板的分离柱进行有效快速的分离，从而得到其相对分子量。

SDS-PAGE法对蛋白质样品的需求量大，染色费时，操作过程较为繁琐且重现性较差。此外，在测试蛋白质分子量的过程中，要特别注意溶液中SDS单体的浓度，保证SDS同蛋白质的比例在一个恰当的数值，才能够使得蛋白质分子同SDS单体充分结合，以消除蛋白质分子原有的电荷差别；否则，最后得到的蛋白质分子量就会有较大的误差。因此，该技术在分子量测试方面已被其他先进技术所取代。

2 高效凝胶过滤色谱-多角度激光光散射技术

凝胶色谱法是根据溶剂分子尺寸的不同进行分离的一种液相色谱法，利用高分子溶液通过填充有多孔的特种凝胶离子的柱子，把分子按从大到小的顺序流出进行分离。它是一种设备简单、操作方便的分离分析技术，对高分子物质有很好的分离效果。高效凝胶过滤色谱作为一种分离技术，常同多角度激光光散射仪等绝对质量分析器联用测试蛋白质分子量。Ye等[2]采用高效凝胶过滤色谱-激光光散射法同时测定蛋白质的聚集、降解以及绝对分子质量。实验中对蛋白质及其聚合体采用高效凝胶过滤色谱分离，多角度激光光散射检测器进行测试，实验研究的方法可以一次进样后同时对蛋白质分子进行定量和分子量测定。丁厚强等[3]采用多角度激光光散射仪与凝胶色谱联用测定了透明质酸钠（HA）相对分子质量及其分布。

高效凝胶过滤色谱-多角度激光光散射技术分离测试蛋白质分子量的缺点在于对分子形状的要求较高，需要标准蛋白与待测蛋白的分子形状一致，测定结果才较为准确。因此，在不清楚待测蛋白分子形状的情况下，测试误差较大，应用有很大的局限性。

3 生物质谱技术

1906年，Thomson发明了质谱技术，最初只是用于无机化学中的同位素分析，直至20世纪40年代末才发展成为有机质谱。近年来，生物质谱技术取得了突飞猛进的发展，其中以电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）和基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）的贡献最为突出。这两项技术的出现，使得生物大分子电离产生气相离子成为可能，传统的用于小分子研究的质谱技术发生了革命性变革，它能够准确分析分子量从几万到几十万的生物大分子。同时，质谱在生物大分子的测定中还具有快速、准确、灵敏等优点，也使得质谱技术在生命科学领域得到长足发展。

3.1 电喷雾离子化质谱技术

电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相的质谱技术。

1984年美国耶鲁大学教授Fenn J B首次发表了电喷雾技术在质谱检测中的应用，并随后报道了运用ESI-MS进行蛋白质分析的科学研究[4]。Fenn的研究成果揭开了ESI-MS用于生物大分子研究的序幕，并推动了溶液体系中多肽与蛋白质分析的巨大发展。Fenn J B也因此获得了2002年诺贝尔化学奖。

ESI-MS测定蛋白质大分子是根据一簇多电荷的质谱峰群，通过解卷积的方式计算得到蛋白质的分子量，由于ESI-MS可以产生多电荷峰，因此使得测试的分子质量范围大大扩大。Green等[5]采用ESI-MS对质量差别很小的蛋白质分子量进行了区分和测定，显示了质谱技术在蛋白质分子量测试上的优势。孔毅等[6]采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效凝胶过滤色谱以及电喷雾离子化质谱3种方法对新发现的一种蛋白质的分子量进行了测定。结果表明，电喷雾离子化质谱同理论分子量最为接近，是目前测试蛋白质分子量最准确的方法之一。另外，研究表明，在溶液中加入改性剂可辅助蛋白质分子的离子化和去溶剂化，大大提高蛋白质分子测定的灵敏度。如根据蛋白质含有较多的碱性氨基酸的特点，在溶液中加入适当的酸性试剂，可以促进蛋白质分子的离子化。Sunia等[7]还讨论了ESI-MS在测定蛋白质分子量过程中受pH值的影响情况，实验表明流动相在较低的pH环境下，有利于正离子模式下含氮碱基化合物的离子化；流动相在较高的pH环境下，有利于负离子模式下含酸性基团的样品的离子化。Voyksner[8]的研究表明甲醇、乙醇、异丙醇等具有较小表面张力的溶剂有利于ESI-MS实验中含水溶剂的去溶剂化，同时可以稀释缓冲盐至质谱正常工作范围内。随着电喷雾电离技术的广泛应用，它对多肽和蛋白质等的生物质谱分析已不仅仅局限于分子量的测试，而在近年来取得了长足的发展。通过HPLC-ESI-MS联用仪分析酶解后的碎片，不需要任何纯化便可用来检测目标肽段[9]，进而确定蛋白质序列、确定和鉴别翻译后修饰、测定蛋白质降解产物等重要工作；ESI-MS还可以分析肽的合成产物、研究非共价蛋白复合物以及对寡核苷酸进行测定等。

ESI-MS的优势在于：（1）对样品的消耗少，不会造成样品的大量浪费；（2）对样品分子质量测试灵敏度、分辨力和准确度都相当高；（3）能够方便地与多种分离技术联用，如毛细管电泳、高效液相色谱等，是解决非挥发性、热不稳定性、极性强的复杂组分化合物的定性定量的高灵敏度检测方法。

3.2 基质辅助激光解吸电离质谱技术

基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）是将待测物悬浮或溶解在一个基体中[6]，基体与待测物形成混晶，当基体吸收激光的能量后，均匀传递给待测物，使待测物瞬间气化并离子化。基体的作用在于保护待测物不会因过强的激光能量导致化合物被破坏。

1987年，日本Shimadzu公司工程师Koichi Tanaka利用基质辅助激光解吸方法成功测定了生物大分子，随后德国科学家Karas M和Hillenkamp F利用有机基质（烟碱酸）成功测试了多种蛋白质和寡核苷酸，开启了MALDI-MS在蛋白质组学应用领域的新篇章[7]。2002年诺贝尔化学奖同时也颁发给了Koichi Tanaka，以表彰他在生物大分子测量领域的卓越贡献。季怡萍等[10]采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测定了钙调蛋白的纯度与分子量，并对所得的结果进行了讨论，实验结果表明该方法具有灵敏度高、分析速度快、重复性好、信息直观等特点，是其他传统测定蛋白质分子量的方法无法比拟的。Jeannot等[11]采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质进行精确分子量测定。实验对凝胶成分十二烷基硫酸钠、甘油以及三羟甲基氨基甲烷缓冲液对质谱信号的影响进行了系统的研究，甘油及三羟甲基氨基甲烷缓冲液对质谱分辨力和准确度几乎没有影响，但即使是在低浓度情况下，十二烷基硫酸钠也会使得质谱的灵敏度、分辨力和准确度降低。在样品前处理中，采取了在凝胶中去除过多SDS的方法，减少了峰形过宽对蛋白质分子量精确测定的影响。此外，基质辅助激光解吸电离技术的发展，使MALDI-MS在蛋白质鉴定、蛋白质相对定量、蛋白翻译后修饰位点鉴定和定量、生物标志物发现、核酸分析-序列确认等方面都有很好的应用。

MALDI-MS的优势在于：（1）同ESI-MS一样对样品的消耗很少；（2）随着质量分析器的不断改进、新的基质的不断发现和应用以及延迟萃取技术的使用，使得MALDI-MS的最高分辨率不断提高，甚至超过 ESI-MS[4]；（3）MALDI-MS 单电荷峰占主要部分，碎片峰少，非常有利于对复杂混合物的分析，且能忍受较高浓度的盐、缓冲剂和其他难挥发成分，降低了对样品预处理的要求；（4）MALDI-TOF质谱对生物大分子分子量的测定范围是所有测试技术中最广的。

4 结束语

蛋白质分子量测试技术是蛋白质相关测量工作的基础，随着基因组计划的快速、全方位的推进，蛋白质分子量测定的科学研究工作必将受到越来越广泛的关注。ESI-MS和MALDI-MS是目前测定蛋白质分子量最先进的方法，两者在样品消耗量、测试灵敏度、分辨力和准确度上都达到很高的水平。ESI-MS的缺点在于对样品纯度要求高，且会形成多电荷的质谱峰群，难以分辨，使得结果分析较为困难。如，ESI-MS在分析糖蛋白时会产生大量的重叠峰[12]。相比于ESI-MS，MALDI-MS对样品纯度要求低，能够测定纯度不高的混合物，降低对样品预处理的要求；并且对蛋白质分子量的测试范围比ESI-MS更广，是未来蛋白质等生物大分子分子量测定的主流工具。但是，MALDI-MS与高效液相色谱、毛细管电泳等分离设备的联用，目前只能采取离线的方式，致使分析结果的重复性较差，与MALDI-MS本身高精密度的特性不匹配，如果能有效解决MALDI-MS与预分离技术的联用问题，必将会使其在生命科学领域获得更广泛的应用，发挥更大的作用。

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