烟草基因组学研究方法篇：5.烟草蛋白质组学研究方法和应用

王绍美

（中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101）

蛋白质组（proteome）最初指细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式，后引申指一个基因组编码的全部蛋白质。蛋白质组研究是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一和功能基因组学研究的新兴学科、热点领域。蛋白质组学研究方法主要是基于蛋白质样品的分离、蛋白质的鉴定及蛋白质间的相互作用等技术。

1 蛋白质组学研究方法

1.1 蛋白质的分离技术

用于蛋白质分离的技术有双向电泳（two-dimensional electrophoreisis,2-DE）、荧光差异双向凝胶电泳（two dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE）、高效液相色谱（RP-HPLC）、毛细管电泳（capillary electrophoresis,CE）、多维液相色谱（MDLC）等技术。其中最主要的技术是双向电泳和高效液相色谱。2-DE基本原理是根据蛋白质等电点和分子量大小不同，先后在两个方向上分离蛋白质复杂组分[1]。这种技术具有分辨率和灵敏度较高，可用于计算机定量分析差异表达蛋白质，用高灵敏度微量化学方法较易对2-DE胶上的分离蛋白质进行鉴定和表征的特点，因此，目前仍是蛋白质分离的核心技术，适宜于进行比较蛋白质组学分析。该技术的缺点是疏水性蛋白（如膜蛋白）难溶于样品缓冲液；高分子量蛋白、极酸和极碱性蛋白易在电泳中丢失；低丰度（拷贝数小于1000）蛋白无法检测等。RP-HPLC作为蛋白质分离和纯化的最常用方法，一般是将液相色谱分离技术与串联质谱联用，首先酶解混合蛋白，再经过适当的色谱分离，并通过串联质谱分析肽段、鉴定蛋白。这项技术将色谱与质谱结合实现了高通量筛选和进行蛋白质混合物鉴定，操作过程简单、分析速度快、分离能力好、灵敏度高，能富集低丰度蛋白，可迅速、完全自动化鉴定极微量蛋白质，但不适用比较蛋白质组学分析。

1.2 蛋白质的鉴定技术

用于蛋白质鉴定的技术主要有传统蛋白质鉴定技术、生物质谱鉴定（mass spectrometry,MS）技术和同位素标记亲和标签法（isotope-coded affinity tags,ICAT）。传统蛋白质鉴定技术指Edman降解法测N端序列和氨基酸组成分析法，前者有测定速度较慢，费用偏高，灵敏度低等缺点；后者因耗资低而常用于蛋白质的鉴定。MS技术因其具有高通量、高准确度、高灵敏度、易于自动化、快速等优点，适用于分析凝胶上的微量蛋白，成为蛋白质鉴定的主要支撑技术。该技术基本原理是先使蛋白质样品分子离子化，然后根据不同离子之间的质荷比（m/z）差异来分离并确定蛋白质相对分子质量，再根据蛋白质酶解后所得到的肽质量指纹图谱（PMF）、肽序列标签（PST）和肽阶梯序列（PLS）去检索蛋白质或核酸序列库[2]。生物质谱分析系统根据离子源不同分为基质辅助激光解析电离质谱（matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry,MALDI-MS）和电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS）。ICAT是采用同位素标记多肽或蛋白质的亲和标签技术，具有灵敏度和准确性高的特点，能用于快速定性和定量鉴定疏水性和低丰度蛋白质，并可直接测试混合样品，进行差异表达蛋白质研究。

1.3 蛋白质相互作用研究技术

应用于蛋白质相互作用的研究技术有酵母双杂交（yeast two-hybrid，Y2Z）系统、噬菌体展示（phage display）技术、蛋白质芯片（protein chip）技术、基于质谱的蛋白质相互作用研究方法等。酵母双杂交系统技术原理是在真核模式生物酵母中，当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后,形成转录激活复合物，诱导已知基因的启动子，从而启动报告基因在酵母细胞内的表达，通过检测该基因表达产物而判别诱饵蛋白和靶蛋白之间是否存在相互作用。该技术具有易于自动化高通量等特点，已成为研究蛋白质相互作用、蛋白质结构与功能、绘制蛋白质相互作用图谱的重要手段，但分析过程中存在假阳性和假阴性的现象。噬菌体展示技术是在编码噬菌体外壳蛋白的pⅢ或pVⅢ基因上连接一个单克隆抗体基因序列的技术。噬菌体生长时表面表达出的相应单抗在过柱时，目的蛋白质可特异性结合相应抗体。该技术具有高通量及简便的特点，它可以检测出酵母双杂交技术检测不出的本身具有激活转录活性的蛋白质。蛋白质芯片技术是一种高通量、微型化和自动化的蛋白质酶联免疫分析技术。该技术的基本原理是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析。

2 蛋白质组学研究方法在烟草中的应用

2.1 应用于基础研究

烟草作为模式生物应可用于蛋白质组学基础研究领域。烟草的Bright-Yellow-2（BY2）细胞系是从烟草幼苗愈伤组织中获得的，该细胞系具有快速生长、易于遗传转化、细胞分裂同步等优点，是目前植物基础研究领域应用最广泛的细胞系之一。Duby等[3]以BY2细胞系作为实验材料，构建了可供蛋白质快速网上鉴定和蛋白质图谱比对的BY2细胞系蛋白质组参考图谱。2008年，Gerber等[4]在烟草BY2细胞系中研究了细菌脂多糖诱导的细胞靶点信号蛋白质组图谱。Goulet等[5]用Nicotiana benthamiana叶片研究质外体蛋白质组的结果，将成为植物与病菌互作或细胞壁代谢以及细胞壁分泌蛋白研究的有用工具。

2.2 应用于逆境胁迫研究

烟草在生长过程中遭受的各种生物胁迫和非生物胁迫会造成烟叶产量、质量下降，这些逆境胁迫会通过逆境感知信号来调控细胞内抗逆相关蛋白质的合成表达，以调整自身生理状态和外部形态适应外界环境变化。为了解释烟草抗逆机制、提高烟草抗逆性，Pineda等[6]、Razavizadeh等[7]、Dani等[8]、王绍美[9]、盖英萍[10]、梁景霞[11]分别对生物胁迫和非生物胁迫下烟草蛋白质组进行了研究。

2.3 应用于代谢调控途径研究

烟草的代谢调控直接影响烟叶的化学成分协调，从而影响烟叶内在品质。2010年，Kaida等[12]研究了紫色酸性磷酸酶在烟草细胞壁蛋白质去磷酸化中的潜在作用；Chivasa等[13]对信号调节物 eATP的影响展开了代谢调控蛋白质组研究。2009年，Millar等[14]开展了烟草细胞系形成次生壁的细胞壁和分泌蛋白质组研究。王茂等[15]进行了信号诱导物结合栽培措施的代谢调控研究。

2.4 不同生态类型烟叶香气风格形成机理研究

我国生产的烟叶因生态条件的影响而具有不同的香气风格，运用蛋白质组学研究可以探讨烟草应答不同生态条件的分子机理和不同生态类型形成不同香气风格的机理[16]。

[1]Görg A,Weiss W,Dunn M J.Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics[J].Proteomics,2004,4:3665-3685.

[2]Shi R,Kumar C,Zougman A,et al.Analysis of the mouse liver proteome using advanced mass spectrometry[J].J Proteome Res,2007,6:2963-2972.

[3]Duby G,Degand H,Faber A M,et al.The proteome complement ofNicotiana tabacum Bright-Yellow-2culture cells[J].Proteomics,2010,10:2545-2550.

[4]Gerber I B,Laukens K,De Vijlder T,et al.Proteomic profiling of cellular targets of lipopolysaccharide-induced signalling inNicotiana tabacumBY-2 cells[J].Biochim Biophys Acta,2008,1784:1750-1762.

[5]Goulet C,Goulet C,Goulet M C,et al.2-DE proteome maps for the leaf apoplast ofNicotiana benthamiana[J].Proteomics,2010,10:2536-2544.

[6]Pineda M,Sajnani C,Baron M.Changes induced by thePepper mild mottle tobamoviruson the chloroplast proteome ofNicotiana benthamiana[J].Photosynth Res,2010,103:31-45.

[7]Razavizadeh R,Ehsanpour A A,Ahsan N,et al.Proteome analysis of tobacco leaves under salt stress[J].Peptides,2009,30:1651-1659.

[8]Dani V,Simon W J,Duranti M,et al.Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress[J].Proteomics,2005,5:737-745.

[9]王绍美.抗性不同的烤烟品种在胁迫条件下烟叶的差异蛋白质组学研究[D].北京：中国农业科学院，2011.

[10]盖英萍.棉花、烟草响应低温胁迫的差异蛋白质组学研究[D].泰安：山东农业大学，2008.

[11]梁景霞.烟草种质ISSR标记及对氮素响应的生理遗传与差异蛋白质组学研究[D].福州：福建农林大学，2008.

[12]Kaida R,Serada S,Norioka N,et al.Potential role for purple acid phosphatase in the dephosphorylation of wall proteins in tobacco cell[J].Plant Physiol,2010,153:603-610.

[13]Chivasa S,Simon W J,Murphy A M,et al.The effects of extracellular adenosine 5′-triphosphate on the tobacco proteome[J].Proteomics,2010,10:235-244.

[14]Millar D J,Whitelegge J P,Bindschedler L V,et al.The cell wall and secretory proteome of a tobacco cell line synthesising secondary wall[J].Proteomics,2009,9:2355-2372.

[15]王茂，张翀，刘卫群.茉莉酸处理烤烟打顶诱导烟碱合成调控相关蛋白质的筛选[J].河南农业大学学报，2009，43（3）：236-255.

[16]崔红，冀浩，张华，等.不同生态区烟草叶片蛋白质组学的比较[J].生态学报，2008，28（10）：4874-4880.