贾第虫病分子生物学诊断方法及其应用

商立民,金洪涛,刘 全

蓝氏贾第鞭毛虫病(giardiasis),简称贾第虫病,是由蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)引起的一种以腹泻为主要症状的肠道疾病,也有人称蓝氏鞭毛虫病(lambliasis)。因贾第虫病曾在国际旅游者中流行,故又称为“旅游者腹泻”。

自20世纪70年代以来,在世界各地相继发生了本病的流行或暴发流行,相关的研究也确认贾第鞭毛虫是导致人类腹泻的最主要寄生性原虫,估计每年导致约2.8亿人感染[1]。近年来,在艾滋病患者中常发现有贾第虫的合并感染,在同性恋人群中本病亦可互相传播,贾第虫已被认为是一种机会致病性原虫,其重要性已引起各国重视。由于贾第虫可感染人和多种野生动物及家养动物,故目前国际上已将贾第虫病列入人兽共患寄生虫病。

贾第虫病呈全球性分布,据WHO估计,全世界人群感染率约为1%～20%,其临床表现复杂多样,从急慢性腹泻、腹痛、恶心、呕吐、胃肠胀气到无明显临床症状[2],极易与其他疾病相混淆,从而忽视或延误了本病的治疗,因此快速、准确诊断对本病的治疗和监控起着十分重要的作用,本文就贾第虫病的分子生物学诊断方法及其应用加以综述。

1 多聚酶链反应(PCR)

对贾第虫进行鉴定和基因分型的靶基因主要有:小亚单位rRNA基因(SSU-rRNA)、β贾第素基因(β-giardin)、谷氨酸脱氢酶基因(gdh)、α-延伸因子1基因(ef-1)、磷酸丙糖异构酶基因(tpi)等[3]。Rebecca等应用PCR方法检测贾第虫小亚单位rDNA基因和传统的检测方法对曼谷204份人粪便和229份犬粪便进行检测比较,结果显示PCR方法具有较高的特异性和敏感性[4]。通过对上述贾第虫特定基因的扩增和序列分析,比较其基因片段的特异性,对贾第虫进行分型,将其分为了7个有效聚集体,即聚集体(A-G)。Erica等对从灰海豹粪便中提取贾第虫基因组,用谷氨酸脱氢酶基因(gdh)进行分型鉴定,在原有的七种聚集体之外发现了第八种聚集体,即集聚体H,这种新聚集体的发现说明贾第虫具有更为丰富的遗传多样性和更为广泛的宿主范围[5]。

2 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)

Real-time PCR方法能够对特异核酸扩增的全过程进行连续的实时监测,能够测定样品起始模板的核酸含量,从而对样品中含有的虫体数量进行定量检测。此外,相对于传统的PCR方法Real-time PCR具有更高的敏感性,而且能够在闭合管内进行高通量分析,无需对扩增产物进行电泳分析,避免了样品污染的可能[6]。

Adriana等用Real-time PCR法与传统的镜检和抗原检测方法对意大利疑似肠道寄生虫感染的771份患者粪便样品进行检测,与传统方法相比较Real-time PCR具有100%的特异性和敏感性[7]。Verweij等用Real-time PCR方法对贾第虫小亚单位rRNA基因进行扩增检测,对104份已知含有贾第虫包囊的粪便标本检测,102份阳性,特异性达到98.1%;对贾第虫抗原阳性的粪便标本进行检测亦呈阳性[8]。Binz等应用探针法荧光定量PCR技术能够检测出0.8个贾第虫滋养体,具有较高的特异性和敏感性[9]。

3 反转录PCR(RT-PCR)

尽管常规PCR方法对样本中存在的贾第虫检测具有高度的特异性和敏感性,但不能区分包囊是否具有活性和感染力,因此在对环境样品检测时,需要建立一种特异的方法来检测环境中样本是否含有有活性的包囊,由于 RT-PCR依赖于mRNA的完整性,而 mRNA的半衰期通常较短,因此完整的mRNA即可证实活性包囊的存在。应用RT-PCR方法检测贾第虫mRNA即可检出样品中是否含有活性包囊。由于包囊在热应激条件下可大量合成热休克蛋白(hsp)70,因此RT-PCR通常将热休克蛋白(hsp)70作为目的基因进行检测,能够增加检测活性包囊的敏感性[10]。

Gyu-Cheol等针对贾第虫的热休克蛋白(hsp)70基因设计特异的引物对水生系统中有活性的包囊进行检测,检测的敏感性可达到1个包囊/100μL,在热应激的条件下检测的敏感性可以增加1000倍,这种检测的高敏感性在检测环境样品中是否含有活性的包囊具有重要意义[11]。

4 多重PCR(multiplex PCR)

多重PCR是通过在同一PCR反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应,可以对多种致病因子进行鉴定和检测,具有高效性、经济性和简便性等特点[12]。

Stark D等应用多重PCR技术与real-time PCR(RT-PCR)相比较用来检测包括贾第虫在内的4种常见的致病原虫,发现多重PCR与RT-PCR的符合率达到100%,而且多重PCR具有很高的特异性和敏感性,没有交叉反应发生[13]。Taniuchi M 等应用多重PCR技术对肠道寄生虫检测的敏感性和特异性分别为83%和100%,故可用此方法对肠道寄生虫进行筛选[14]。

5 基因芯片技术(microarray)

基因芯片技术(microarray)是指将成千上万DNA克隆片段或寡核苷酸片段固定在固体表面(玻璃片或尼龙膜)上,用荧光或其他标记的mRNA,cDNA或基因组DNA探针进行杂交,从而同时快速检测多个基因表达状况,进行DNA分析等的一种技术,其基本原理是基于Southern杂交或斑点杂交技术。基因芯片技术应用于基因表达水平检测的最大优越性是可自动、快速检测目的材料中成千上万个基因的表达情况。

Dae-Young等研制了针对小亚基 rRNA基因检测包括贾第虫在内的三种原虫基因芯片技术,其检测的敏感性可达到50个包囊/次,该技术能够避免环境样品中存在的PCR抑制剂对PCR检测的影响,具有很好的特异性,不与非靶基因发生交叉反应也无假阴性反应[15]。Wang等研制的寡核苷酸微阵列技术不仅能够对贾第虫进行检测,而且还能对其进行基因分型,其高度的敏感性和特异性为大量临床和环境样品的检测和基因分型提供了一种行之有效的方法[16]。

6 荧光原位杂交(FISH)

荧光原位杂交技术的基本原理是应用荧光标记的核酸探针与同源互补的靶DNA经变性-退火-复性,形成靶DNA与核酸探针的杂交体,经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

Lemos等用FISH方法与贾第虫18S rRNA进行杂交对贾第虫进行检测[17],Dorsch等针对贾第虫16S rRNA设计的荧光标记的寡核苷酸探针,利用rRNA只在有活性的包囊中高效表达的特性,对贾第虫有活性的包囊进行检测[18],Graczyk等将荧光原位杂交技术与针对贾第虫细胞壁抗原决定簇的FITC标记的单克隆抗体技术相结合,能够对贾第虫有活性的单个包囊进行检测[19]。

7 环介导等温扩增(LAMP)

环介导等温扩增技术是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物,在具有链置换活性功能的DNA聚合酶的作用下实现等温条件下DNA分子的核酸扩增技术,该方法具有特异性高、操作方便等特点[20]。

Nago TT等应用LAMP技术对贾第虫病患者的粪便样本进行检测,结果显示检测敏感性为84%(16/19),能够检出的最少虫体数可达到3.12×10-1个,相对于传统的镜检方法敏感性提高了400倍以上,从而为临床样本的检测提供了一种高敏感性和准确性的方法[21]。

8 展 望

分子生物学技术为贾第虫的快速诊断提供了一个平台,各种检测方法的应用使我们对贾第虫的生物学有了更进一步的认识。视检测目的不同,采用不同的检测方法,PCR方法可以对贾第虫进行检测、基因分型和流行病学调查,Real-time PCR可对环境样品贾第虫含量进行定量分析,RT-PCR主要是对环境样品中含有的包囊进行活性和感染力的检测,多重PCR可同时检测多种寄生虫,基因芯片技术可同时对多个不同的目的基因进行检测等。随着分子生物学的迅速发展以及其在贾第虫方面的广泛应用,将有助于对贾第虫的宿主特异性、传播途径和流行趋势等方面有更好的了解。

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