饲料中β-兴奋剂检测方法的研究进展

陕西理工学院化学与环境科学学院 陶亮亮

陕西理工学院生物科学与工程学院 寇 庆 梁咪娟

俗称的“瘦肉精”实际上就是β-肾上腺素兴奋剂，简称 β-兴奋剂（β-agonist）或 β-激动剂（湛嘉等，2009；Martin，2002），主要包含 7 种物质：盐酸克伦特罗（传统瘦肉精）、莱克多巴胺、沙丁胺醇、硫酸特布他林、硫酸沙丁胺醇、西巴特罗、盐酸多巴胺。在饲料中添加β-兴奋剂能使禽畜肌肉比例提高，增大禽畜的瘦肉率，因此β-兴奋剂一度被用于畜牧生产（Cheng 等，2009；李杰，2003；杨志凌和林映才，2003）。然而β-兴奋剂在内脏中积累较严重，并可通过食物链进入人体，严重危害身体健康（贾强等，2005；Adrin 等，2005；尹靖东等，1998）。以往国家执法人员多检测盐酸克伦特罗，近年来莱克多巴胺也被列入检测范围，其余5种则极少被检测。目前对β-肾上腺素兴奋剂的检测方法主要分5大类：简易检验法、色谱技术、免疫分析、生物传感器法和生物芯片法，本文主要这几种检测方法进行介绍。

1 简易检验法

对于养殖场或者屠宰场在屠宰前的生猪，可以通过外表观察进行初步判断，一般食用 “瘦肉精”的生猪皮毛光亮，后臀结实、突出且外形饱满，呼吸频率加快，四肢不同程度的颤抖，严重者卧地不起，通过这些表现在生猪屠宰前即可做出初步的判断。对于屠宰后的生猪也可做宰后简易检验，首先从感官进行判断，喂食 “瘦肉精”后的猪肉颜色鲜艳并且较深，纤维比较疏松，脂肪层薄，瘦肉与脂肪间或有黄色液体流出，后肢与腹部之间的脂肪层内分布较密集的毛细血管，颜色深的部位呈现出充血状态。也可通过酸碱试纸检测，正常肉类多呈中性或弱碱性，而喂食“瘦肉精”的肉类偏酸性。

2 高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）在测定一些对热不稳定和强极性的β-兴奋剂类物质方面显示出较好的效果，目前的趋势是将HPLC和质谱（MS）系统联用，以实现分析过程的自动化。HPLC法采用高压泵和高效固定相结合的高灵敏度的紫外检测器、电化学检测器和质谱检测器。应用HPLC法检测盐酸克伦特罗时无需衍生过程，利用β-兴奋剂分子能够与固定相C8或C18分子相互作用，结合反相柱即可检测出β-兴奋剂类物质。正是因为HPLC法具有专属性好、选择性强、检测精确度较高，而且假阳性率低等优点，我国目前已将HPLC法作为检测盐酸克伦特罗的半确证性方法，此法目前的最低检测范围为1～15 ng/g。但是HPLC法在实际应用中受到一定的限制，主要是因为此法所需的样品处理时间长、检测过程繁琐、要求专门的技术人员进行操作等问题 （苗虹等，2010；安洪泽等，2008）。

3 气相色谱-质谱法

气相色谱-质谱法（GC-MS）把色谱的高效快速分离能力与质谱高灵敏度的定性分析能力相结合，因此其既适合单组分测定，也适合在多组分同时存在的情况下对某种特定的组分进行定性或定量分析，是非常有效、准确而又灵敏的方法（孔莹等，2006； 吴平谷和虞晓珍，2005；Jose 等，2005）。Batioens等（1996）用 GC-MS-MS 法对猪、牛和羊的肌肉、肝脏等组织中残留的“瘦肉精”进行检测，结果显示最低检测标准为2 ng/g；Fente等（1999）使用GC-MS法对牛毛中残留的“瘦肉精”进行检测，结果显示最低检测标准为5 ng/g；另外，GCMS法与HPLC法相比，检测灵敏度更高，假阳性率更低。Biancotto等（1999）通过对盐酸克伦特罗分子中的羟基进行硅烷化衍生，然后GC-MS方法检测最低检测标准为0.12 ng/mL。Abukhalaf等（2000）用GC-MS分别在尿液及血液中的最低检测标准分别为0.15 ng/mL和0.12 ng/mL。

4 毛细管区带电泳法

当传统的液相色谱法分离的离子化样品的分离与分析出现困难时，毛细管区带电泳法（CE）的优越性就显示出来了，CE法适用于那些其分离效率可达几百万理论板塔数的检测任务。Gausepohl等（1998）应用CE技术检测人尿中盐酸克伦特罗的残留，使用pH 3.3的磷酸盐缓冲液，最低检测限达到0.5 ng/mL，而且精确度和准确度均已符合生物样品中残留物的检测标准。王伟宇等（2008）采用小型化毛细管电泳-电化学检测技术测定了猪尿和猪饲料中的克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇， 检测限为1.20×10-7～ 2.06×10-7g/mL，进一步证实了CE法简单且有效。CE法的主要优点是灵活性大，操作简单、重复性强、精度高，所需样品量少，并且CE法对检测中所需的缓冲液的组成和pH值、检测用毛细管的种类和型号、以及检测中的电场波形等都可以调节，这些可调节的参数大大拓展了CE法的应用范围。但是，目前CE法在分析样品过程中同样也存着一些亟待解决的问题，检测时间长和缺乏合适的检测器是制约该法应用的主要瓶颈，但不可否认的是随着这些困难的克服，CE法将会具有更高的研究价值和应用前景。

5 酶联免疫吸附法

目前，酶联免疫吸附技术（ELISA）被认为是检测盐酸克伦特罗较高效的免疫分析方法。ELISA法的原理是利用抗原和抗体特异性结合和酶的高效催化作用，将辣根过氧化物酶与克伦特罗结合，形成酶与偶联克伦特罗的复合物。将包被的抗体固定于载体上，使其与特异性的抗克伦特罗抗体结合，将酶偶联克伦特罗和待测克伦特罗同时加入，二者会与克伦特罗抗体发生竞争性结合，经过洗涤后加入底物，经充分反应后，可依据有色物的颜色变化程度来对待测克伦特罗进行计量。如果两者中待测克伦特罗数量多，那么被结合的酶偶联克伦特罗数量则少，这样有色物的量就少，最后可用比色法测定样品中的克伦特罗含量（高彬文等，2009；胥传来等，2005）。我国在使用ELISA法检测盐酸克伦特罗方面的研究起步较晚，但近几年发展较快，目前采用单克隆抗体技术已成功开发出检测试剂盒，在特异性方面与国外同类产品相当，并且检测灵敏度可达到农业部监督检测标准值0.5×10-9的要求。

6 生物传感器技术

生物传感器（BS）是近年来发展起来的一种可以用于分析检测β-激动剂类物质的高效的新型设备。BS是由生物活性物质作为敏感元件再结合适当的换能器及输出显示装置所构成的分析工具。BS法的原理是当传感器的分子识别部分与被识别物质相接触后，通过引发化学变化、光变化和热变化，来直接诱导产生电信号，进一步利用电学测量方法进行检测、控制和输出结果的方法。1967年Updike等制出了第一个生物传感器用于检测葡萄糖。Traynor等（2003）采用表面等离子体共振生物传感器对肝脏组织的β-激动剂类物质进行的检测取得了令人满意的效果。未来的生物传感器需要与计算机紧密结合，能够自动采集和处理数据，更加科学准确地呈现数据，实现采样、进样、显示、分析等的自动化，同时，芯片技术将整合进传感器，以实现检测系统的集成化。

7 生物芯片技术

生物芯片技术（biochip）是生命科学领域中迅速崛起的一项高新技术，是在玻璃片、硅片等材料上固定样本，通过微加工技术以实现对核酸、蛋白质、化合物等准确、快速、高通量的检测（Wang等，2006；Walsh 和 Chang，2004）。 与传统的检测方法相比，生物芯片的突出优点是能够在短时间内分析大量的被检分子，如饲料中违规添加剂和兽药残留的检测、微生物的检测和动植基因突变的检测等（Bertram等，2004）。目前的兽药残留蛋白质免疫芯片检测系统，能够在几分钟内检测出饲料、肉品、乳品中的添加剂残留量。饲料或肉类中的违规添加剂一般是小分子化学物质，检测时可用快速提取仪进行提取，与抗体混合放置芯片上，通过抗原抗体发生竞争性免疫反应，再经激光共聚焦扫描仪扫描，最后通过计算机自动判断是否超标（Wang 等，2006；Walsh 等 2004）。 目前此生物芯片系统可对包括β-激动剂、链霉素、磺胺二甲嘧啶等进行检测。

8 小结

目前，HPLC、GC-MS、CE 方法对 β-兴奋剂的最低检测限均在0.5 ng/g左右，并且检测过程耗时长，必须要由专业人员来操作，所用的仪器价格昂贵，而且不能进行现场检测。而免疫学法中的ELISA法的最低检测限为0.05 ng/g，灵敏度和精确度都符合农业部的标准，但假阳性率高是一直未能解决的难题，而且ELISA法也不能进行现场检测。因此，如果能找到一种检测耗时短、准确度高、灵敏度高、自动化水平很高、无需专业人员操作的检测方法将具有非常广阔的应用前景，预计未来几年开发这种检测方法的研究必将成为热点。

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