Cyt-C与caspase在细胞凋亡中的作用及相互关系

朱炎杰 高维娟 (承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000)

细胞凋亡，又称细胞程序性死亡，是指细胞在一定的生理或病理性条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，是一种主动的、程序性的、细胞固有的生物学过程，其特征是一系列细胞形态学的改变，包括染色体浓缩、核碎裂、细胞皱缩、凋亡小体形成等〔1，2〕。近年研究发现，脑缺血再灌注致神经细胞死亡主要由凋亡所致〔3，4〕，细胞色素C(Cyt-C)和天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)家族在细胞凋亡的发生和发展中起着关键作用〔5〕。近年来对两种酶与各种疾病以及两种酶与凋亡的研究逐渐增加，本文将就此作出综述，同时探讨二者在细胞凋亡中的关系。

1 Cyt-C与细胞凋亡

1.1 Cyt-C概述 Cyt-C是一种水溶性蛋白，由核基因编码，分子量为12～13 kD，位于线粒体内膜的外侧，呼吸链复合体Ⅲ～Ⅳ之间，Cyt-C是线粒体呼吸链(MRC)中传递电子的载体。对线粒体能量代谢起重要的调节作用〔6〕。

无活性前体分子在胞浆内合成的前Cyt-C是一种核基因编码的水溶性蛋白，其相对分子质量为12～13 kD。电子在转运的过程中，伴随着质子从基质被泵到线粒体膜间隙，从而建立线粒体跨膜电位(ΔΦm)。当质子从线粒体膜间隙反流回基质中，使另一个蛋白复合分子FOF1-ATP酶(或复合物Ⅴ)产生ATP。所有这些过程必须有序地进行。如果Cyt-C缺失或其功能障碍将会导致线粒体呼吸链出现功能异常，结果ATP缺乏，使细胞死亡。在细胞凋亡过程中Cyt-C释放进入胞质，与凋亡活化因子1(Apaf-1)结合，Apaf-1与线虫的Ced-4相似，它的氨基端由caspase循环结构域组成，羧基端有12个WD-40重复区，中间320个氨基酸残基则与Ced-4有22%的同源，48%的相似性。Cyt-C可与Apaf-1的羧基端结合，通过Apaf-1的氨基端再与procaspase-9的功能前区相互作用，形成相对分子质量为 700 ×103～1 400 ×103的巨大复合物〔7～9〕，自发激活caspase-9。Cyt-C/Apaf-1/caspase-9复合物即谓凋亡体，凋亡体内活化的caspase-9作为蛋白酶激活下游的caspase家族如caspase-3、easpase-7。其中caspase-3是主要的凋亡效应蛋白，它可激活CAD及ACINUS，继而引起细胞核浓缩及DNA裂解，使细胞发生凋亡〔10〕。研究表明，在凋亡初期，Cyt-C从线粒体内膜释放，启动细胞的凋亡机制。

1.2 Cyt-C在线粒体中的释放机制 目前Cyt-C释放的机制主要有两种〔11，12〕:一是线粒体外膜蛋白聚合形成膜通透转运孔(PTP)复合体，导致外膜非特异性断裂〔13〕;二是促凋亡基因Bax的诱导作用，引发了细胞的凋亡。但抗凋亡基因Bcl-2可以阻断Cyt-C的释放和caspase的活化;Bcl-2家族蛋白如Bcl-2、Bcl-xL和Bax具有成孔性质，估计它们直接调节线粒体膜对Cyt-C的通透性〔14，15〕。Cyt-C的释放是细胞死亡程序中关键的一步。一种类似白细胞介素1B转换酶的caspase的激活是Fas和肿瘤坏死因子仅受体信号途径的早期过程。该酶的抑制阻止了Cyt-C从线粒体中释放，也抑制了Fas介导的细胞凋亡。但至今还未证实caspase与线粒体膜的主要成分直接反应。在很多细胞凋亡实验中，caspase抑制剂并不能导致Cyt-C的释放。由此可见，线粒体向胞质释放一些凋亡相关因子，启动凋亡反应，其中最重要的是Cyt-C。

1.3 Cyt-C在细胞凋亡中的作用 线粒体Cyt-C是凋亡发生的阀门，能通过调节细胞能量代谢决定细胞死亡方式。细胞受刺激后发生凋亡还是坏死，很大程度上取决于细胞内ATP水平。如Cyt-C释放后，细胞内ATP仍能维持适当水平，则释放到胞浆的Cyt-C可通过激活caspase来介导细胞凋亡;如释放后细胞内ATP不能维持适当的水平，则细胞发生坏死。Cyt-C在凋亡中的作用，最初是在以胞浆抽提体系对凋亡研究时发现的，即核凋亡(DNA片段化)依赖于某种细胞器碎片存在，随后证实这种细胞器碎片的成分是Cyt-C。进一步研究发现，线粒体释放到胞浆的Cyt-C可通过与apaf-1结合，招募caspase-9聚集，激活 Procaspase;在 dATP存在时，caspase-9可直接活化caspase-3，介导细胞凋亡〔16〕。

Cyt-C可通过对凋亡信号的传导和放大作用调控细胞凋亡，此作用正在被逐渐阐明。凋亡信号传导有三条基本途径:第一条是由膜受体(如 FasL)介导，激活 caspase-8，再激活caspase-3，介导细胞凋亡。除直接活化caspase-3外，在Ⅱ型细胞(如肝细胞)，caspase-8还能通过裂解胞浆蛋白p22 Bid;引起线粒体细胞色素C释放，并激活caspase-9、再活化caspase3，介导细胞凋亡。Ⅰ型细胞没有这条分支，Bcl-2对膜受体介导的Ⅰ型细胞凋亡无保护作用。有研究报道〔17，18〕，caspase-8直接活化caspase-3的能力与活化的caspase-8的量有关，Cyt-C能放大这种效应，确保收到凋亡信号的细胞发生凋亡。在某些细胞类型，由caspase-8直接活化的caspase-3在凋亡过程中可能不起主要作用。如在TNF-α诱导L929细胞凋亡实验中发现，尽管caspase-8可以直接激活caspase-3，但这并不是caspase-3激活的主要方式，因为caspase-8抑制剂对细胞存活率和caspase-3活性没有影响，而抑制Cyt-C释放不仅可明显降低 caspase-3活性，而且显著提高细胞存活率，提示线粒体释放Cyt-C途径是caspase-3活化的主要方式。第二条是由线粒体膜功能紊乱或损伤介导，各种凋亡诱导剂超载作用于线粒体，引起线粒体Cyt-C释放，激活 caspase-9、再活化 caspase-3、-7，介导细胞凋亡。第三条途径，即内质网应激，引起内质网钙释放，导致胞浆内钙稳态失衡，激活caspase-12，介导细胞凋亡。此外，Cyt-C释放还可通过引起线粒体呼吸链电子传递障碍，使活性氧(RoS)产生增加，介导细胞凋亡〔19〕。

2 caspase与细胞凋亡

2.1 caspase家族概述 caspase全称为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶〔20〕。caspase是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶。它们的活性位点均包含半胱氨酸残基，能够特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键。caspase负责选择性的切割某些蛋白质，从而造成细胞凋亡。caspase蛋白族的分类从1992年人类第1次纯化caspase-l并测序其cDNA，迄今为止已发现哺乳动物至少有14种caspase蛋白酶家族成员。根据caspase之间大小亚单位序列的同源性以及功能，可分为3组:①细胞因子处理组:caspase-l、-4、-5、-11、-12、-13、-14;②凋亡起始组Caspase-2、-8、-9和-10;③凋亡效应组caspase-3、-6和-7。caspase在细胞内合成和分泌。酶原含有3个结构域，一个NH2-端结构域，一个大的亚单位(相对分子质量约20×103)和一个小的亚单位(相对分子质量约10×103)。

所有的成员都保守性地包含有与底物P1Asp作用的氨基酸残基，如在ICE中，它们是催化中心的Cys285，与酶/抑制剂复合物的巯基半缩醛以氢键结合的His237，以及可以稳定反应中间物氧阴离子的 Gly238。另外，Arg179、Arg341、Gln383和 Ser347形成容纳P1Asp的“口袋”，Ser339靠近Cys285的巯基，以氢键结合P1位的酰胺。与P2～P4作用的氨基酸残基则变异比较大，这可能是各个成员识别不同底物的特异性之所在。在活性Cys周围的氨基酸序列也很保守，一般都有 Gln-Ala-Cys-Arg-Gly(QACRG)五肽序列，在 caspase-8、caspase-10中为 QACQG，在caspase-9中是QACGG，这三个成员都有一个氨基酸残基的变异，但这种变异不影响蛋白酶的剪切活性和特异性。

2.2 caspase的活化 未活化的caspase家族蛋白酶是以酶原形式存在的，酶原的氨基端有一段被称为“原结构域”(pro-domain)的序列。酶原活化时不但要将原结构域切除，并且要将剩余部分剪切成一大一小两个亚基，分别称为P20和P10，活性酶就是由这两种亚基以(P20/P10)2的形式组成的。这种活化反应也是Asp特异的，剪切发生在酶原中保守序列的Asp与其后的氨基酸残基之间，一般是先切下羧基端的小亚基，然后再从大亚基的氨基端切去原结构域。这种剪切可以是酶原及中间活性酶自我催化，也可以是其他ICE家族蛋白酶的作用，还有其他酶类如颗粒酶B参与。

caspase蛋白酶在死亡受体介导的细胞凋亡中起着中心的作用〔21〕。Fas与配体结合而活化后，首先引起YVAD和zVAD敏感的ICE家族蛋白酶活化，然后再活化DEVD敏感的蛋白酶。其中caspase-8是这一凋亡过程中首先被活化的ICE家族蛋白酶。caspase-8活化后，一方面它可以剪切活化caspase-3、caspase-7、caspase-4、caspase-9 和 caspase-10，通过这些蛋白酶剪切底物使凋亡得以进行;另一方面，它的活性可以被CrmA所抑制，籍此可作为细胞凋亡负调控因素作用的环节。

caspase-8的活化可以是Fas与其配体结合引起的FADD蛋白与caspase-8结合的结果，也可能是颗粒酶B、ICE等作用的结果。所以其他能够引起细胞凋亡的因素也可以通过激活颗粒酶B或ICE来激活凋亡信号转导途径。caspase-8活化后引起caspase-3和caspase-7活化，这两种酶都可以剪切PARP，引起DNA的降解。另外caspase-3还可以活化caspase-6，后者可以降解层蛋白B。此外，U1核糖体蛋白的70 kD亚基(U1-70K)、DNA依赖的蛋白(DNA-PK)的催化亚基、微丝相关蛋白Gas-2、-actin、PKC、视网膜母细胞瘤蛋白、DNA拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ等也都可能作为caspase-3和caspase-6的作用底物。在哺乳动物细胞的凋亡过程中caspase-3、-6、-7是与CED-3最相似的蛋白酶，它们完成了大部分剪切底物的作用，发挥了CED-3在美丽线虫中发挥的作用。

2.3 caspase在细胞凋亡中的作用 caspase在凋亡的执行过程中以一种很有程序的方式对细胞进行解体。它们切断凋亡细胞与周围细胞的联系，关闭DNA的复制与修复，阻断RNA的剪接，降解DNA，破坏核的结构，诱导细胞向外发出信号以便被周围的细胞吞噬，最后将细胞解体并包裹形成凋亡小体。

目前与caspase有关的凋亡通路至少有3种〔22〕:Cyt-C通路、死亡受体通路和内质网通路。caspase凋亡的所有途径最终都是激活caspase-3而导致细胞凋亡，因此caspase-3被认为是各种凋亡刺激因子激活的caspase家族中的关键蛋白酶〔23〕。但要使下游的caspase-3激活，除了它的自我激活和非caspase蛋白酶活化外，起始caspase的转活化也是很重要的。caspase-3是凋亡启动蛋白，在caspases家族中起关键作用，caspase-9是caspase-3的上游调控蛋白，caspase-9的活化能激活caspase-3而使细胞发生凋亡。研究证明〔24〕，Apaf-3就是caspase-9，在生物体内的心脏，睾丸和卵巢具有高水平的mRNA表达，在dATP存在的条件下通过Apaf-1和Cyt-C可以直接激活caspase-9。caspase-9 是个多功能的分子，间接活化 caspase-2、-6、-8、-10，直接活化 caspase-3、-7。

3 Cyt-C与caspase在细胞凋亡中的相互关系

线粒体Cyt-C与caspase之间关系密切。正常情况下caspase以无活性酶原形式存在于活细胞中，当收到凋亡诱导信号刺激时，通过对其内部门冬氨酸残基位点的蛋白水解而激活。一旦caspase激活，将引发caspase级联反应，通过裂解特异性底物及激活内源性核酸酶，使凋亡细胞呈现典型的形态学和生物化学特征。线粒体释放到胞浆中的Cyt-C可通过与Apaf-1结合，活化caspase-9，启动caspase级联反应介导细胞凋亡;而活化的caspase可通过对胞浆底物的裂解促进线粒体Cyt-C释放，如 caspase-8能通过对 Bcl-2家族促凋亡蛋白p22Bid的裂解，促进线粒体 Cyt-C释放，caspase-3、-6、-7不能裂解p22Bid，但可通过对其他胞浆底物的裂解，启动线粒体Cyt-C释放。资料提示:caspase可对胞浆底物裂解启动Cyt-C释放，在凋亡过程中具有放大caspase瀑布效应及促进细胞凋亡的作用〔25，26〕。

4 结语

Cyt-C具有调控细胞能量代谢和凋亡的双重功能。通过调节细胞能量代谢，Cyt-C可调控细胞死亡方式，通过对凋亡信号的传导和放大作用及引起ROS产生增加，线粒体Cyt-C可直接介导细胞凋亡。大量研究结果支持Cyt-C的释放促进细胞凋亡。caspase在细胞凋亡过程中也发挥着重要的促进作用。研究发现Cyt-C的释放早于caspase的活化，对Cyt-C和caspase的深入研究将进一步揭示一些疾病的发生发展机制，并可能提供疾病预防和治疗的新思路。

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