系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞APO2.7的表达及意义

李 明 朱 芸 马晶晶 赵雪丽 (潍坊市人民医院风湿免疫科，潍坊261041)

越来越多的研究发现系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)淋巴细胞的多克隆活化与淋巴细胞的凋亡紊乱密切相关。在细胞凋亡的调控系统中，线粒体膜蛋白的特异性抗体(APO2.7)是与Fas同族的膜蛋白，是凋亡细胞的一个早期反应。本研究通过测定SLE患者不同时期外周血淋巴细胞APO2.7的表达，探讨系统性红斑狼疮与淋巴细胞凋亡的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 SLE患者均为2003年6月～2009年3月本院住院病人，所有病例均符合1997年美国风湿病学会修订的SLE分类诊断标准，以SLE疾病活动评分(SLEDAI)判断疾病的活动度，SLEDAI≥8分为活动期，＜8分为非活动期。46例患者中女性38例，男性8例，年龄最大62岁，最小16岁，平均年龄(30.73±10.31)岁，活动期31例，非活动期15例，病程最长96个月，最短3个月。正常对照为门诊体检正常人群20名。经详细询问病史及系统查体，排除可疑带病者。两组在性别和年龄构成上差异无统计学意义。

1.2 研究方法

1.2.1 特殊试剂 藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人APO2.7(APO2.7-PE);用于免疫阴性对照性的IgG1-PE均为美国Pharmingen生产的产品，由北京岳泰生物公司提供。淋巴细胞分离液由中国医学科学院血液研究研所生产。

1.2.2 淋巴细胞的制备 取肝素抗凝血2 ml，重层于淋巴细胞分离液上，1 500 r/min，离心15分钟，提取其中的淋巴细胞层，再用PBS洗脱2次，弃上清液备用。

1.2.3 免疫反应 取2支试管各加待测的淋巴细胞悬液500 μl(细胞数为106ml-1)，其中的一支淋巴细胞悬液管加单抗工作液20 μl，另一支加阴性对照单抗IgG1-PE，避光反应20分钟，待测。

1.2.4 流式细胞仪(FACScan型，美国BD公司生产)检测 光源488 nm的氢离子激光，上机前以标准荧光微球调整仪器的变异系数并稳定在2%以内，上机后收集2万个细胞，荧光强度以对数放大，光散射数据存盘，测试完后在Macintosh 650计算机上用CellQuest Plot软件程序(美国BD公司提供)分析数据，以标记阳性淋巴细胞百分率表示表达水平。

1.3 统计学处理 实验数据分析使用SPSS11.0软件处理，以±s表示，两样本均数比较采用t检验，相关性分析采用Spearman分析，以P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 SLE患者外周血APO2.7的测定结果 46例SLE患者外周血APO2.7水平为(25.62±13.24)%，高于20例正常对照组(5.89±1.62)%(P＜0.05)。31例活动期SLE患者外周血APO2.7水平为(58.71±24.41)%，15例稳定期SLE患者外周血APO2.7水平为(12.22±6.44)%，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 外周血APO2.7水平与SLE患者SLEDAI评分、ESR、C3补体水平的相关性分析 46例SLE患者外周血APO2.7水平与ESR、IgG、SLEDAI评分呈正相关(r=0.581、0.577、0.552，P ＜ 0.05) ，与 C3补体水平呈负相关(r=-0.512，P＜0.05)。

3 讨论

系统性红斑狼疮是一种常见的自身免疫性疾病，主要免疫学特征是淋巴细胞的功能紊乱，已有研究发现，SLE的发生和发展可能与淋巴细胞凋亡有关，SLE患者淋巴细胞在组织培养中，其凋亡率明显高于正常淋巴细胞[1，2]。细胞凋亡与SLE的关系国内已多有报道，主要集中在Fas介导的凋亡机制研究方面，研究结果并不一致[3，4]。王晓乐等[5]研究发现SLE异常增高的IL-10促使 T细胞高表达FasL，诱导CD4+T细胞凋亡，参与了SLE的病理进程，郝加虎等[6]发现SLE患者的PBMCs早期凋亡率显著升高，且与患者的疾病活动度和器官/系统损害程度相关。Dieker等[7]的研究显示细胞凋亡在自身抗体特别是抗核小体生成过程中发挥了重要作用。

线粒体是细胞凋亡的中心环节，APO2.7分子量为38 000，是由Zhang等[8]首先报道的新的细胞凋亡标志，有促进细胞凋亡的作用，主要通过线粒体途径介导细胞凋亡。APO2.7在凋亡检测中极具前景，是凋亡细胞的一个早期反应，早于细胞形态学和光学特性的变化。陈宏新等[9]研究提示APO2.7可能不是凋亡测定的特定标志而是在细胞死亡(凋亡和坏死)过程中发挥作用。

目前，国内对 APO2.7的研究不多，张璇等[10]检测系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞APO2.7水平高于对照组。本资料发现SLE患者淋巴细胞APO2.7水平明显高于正常组，且SLE活动期较非活动期高，而APO2.7表达率的增加导致了对其介导的凋亡的敏感性增加，从而可能引起淋巴细胞的凋亡率增高，提示SLE活动期较非活动期凋亡增加。传统认为药物如糖皮质激素、细胞毒药物可诱导细胞凋亡，本组31例活动期患者均在未接受任何药物前收集血样，所以活动期患者凋亡增加，可以认为与药物无关，而与SLE患者淋巴细胞本身免疫异常有关。淋巴细胞凋亡在SLE发病中的作用十分复杂，彭春林等[11]研究揭示了外界环境和遗传作用共同启动的细胞凋亡在SLE发病的作用。大体机制可能为:在特定外界刺激下，SLE患者本身免疫紊乱导致淋巴细胞凋亡增加，淋巴细胞在非正常凋亡过程中暴露产生各种细胞自身抗原片段，诱使多种自身抗体生成，如抗核小体抗体，从而加重自身免疫反应，免疫状态的混乱会启动新的细胞凋亡、炎症的加重等多种病理过程。淋巴细胞APO2.7水平与SLE疾病活动指数SLEDAI、ESR、IgG正相关，表明凋亡越明显，病情越重，提示APO2.7与SLE的病情活动密切相关:凋亡早期APO2.7阳性表达率较显著，可以预测早期细胞凋亡损伤的程度和估价预后。

1 Bell DA，Morrison B，VandenBygaart P.Immunogenic DNA-related factors.Nucleosomes spontaneously released from normal murine lymphoid cells stimulate proliferation and immunoglobulin synthesis of normal mouse lymphocytes[J].J Clin Invest，1990;85(5):1487-1496.

2 Kalden J R.Defective phagocytosis of apoptotic cells:possible explanation for the induction of autoantibodies in SLE[J].Lupus，1997;6(3):326-327.

3 王晓非，蒋 莉，赵丽娟 et al.甲基强的松龙和环磷酰胺诱导系统性红斑狼疮患者血中淋巴细胞凋亡的研究[J].中华风湿病学杂志，1999;3(4):241-243.

4 邱明山，阮诗玮，王 智 et al.狼疮肾炎患者外周血淋巴细胞凋亡调控因子和血清尿白细胞介素-8的变化[J].中华风湿病学杂志，2004;8(1)1:20-22.

5 王晓乐，吴秀梅，陈 斌et al.系统性红斑狼疮患者血清IL-10与T细胞凋亡的关系研究[J].南京医科大学学报(自然科学版)，2007;10(11):1118-1122.

6 郝加虎，张志华，张国庆 et al.外周血单个核细胞早期凋亡与SLE患者器官/系统损害的关联研究[J].中国卫生检验杂志，2008;18(6):1025-1029.

7 Dieker J，Muller S.Post-translational modifications，subcellular relocation and release in apoptotic microparticles:apoptosis turns nuclear proteins into autoantigens[J].Clin Immunol，2009;132(3):349-361.

8 Zhang C H，AO Z，Schlossman S F et al.A mitochondrial membrane protein defined by a novel monoclonal antibody is preferentially detected in apoptotic cells[J].J Immunol，1996;157:3980-3987.

9 陈宏新，沈立松，沈 霞.APO2.7在凋亡和坏死的HL-60细胞中的表达[J].上海第二医科大学学报，2001;21(3):206-209.

10 张 璇，吕维红，安志洁.Apo2.7抗体标记原位法在SLE患者外周血淋巴细胞凋亡检测中的应用[J].齐鲁医学检验，2003;14(4):7-9.

11 彭春林，江 峰，王宝涛et al.程序性细胞凋亡1基因单倍型及紫外线暴露与系统性红斑狼疮的相关性研究[J].中华医学遗传学杂志，2010;27(4):417-422.