日本血吸虫蛋白质组学研究

张 旻，傅志强，林矫矫

（中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241）

蛋白质组学是研究一种细胞、组织或完整生物体在特定时空上由全部基因表达的全部蛋白质及其存在方式，注重研究参与特定生理或病理状态下所表达的蛋白质类型及其同周围生物大分子之间的相互关系。蛋白质是基因功能的具体实施者，因而蛋白质组研究可以为揭示生命活动现象的本质提供直接的依据。日本血吸虫病（Schistosomiasis japonicum）是由日本血吸虫尾蚴感染人和哺乳动物引起的、危害严重的人畜共患寄生虫病（zoonosis），是中国优先防治的重大传染病之一。截止2009年底，中国仍有日本血吸虫病患者36.57万[1]。日本血吸虫生活史复杂，各发育阶段虫体具有独特的生命特征，深入了解血吸虫蛋白质组信息有助于日本血吸虫的生长发育、免疫逃避等机制，为开发新型抗血吸虫病疫苗、治疗药物和诊断提究进展进行了综述。

1 蛋白质组学研究技术

蛋白质组学研究主要包括蛋白质组分分离、鉴定以及对鉴定结果的生物信息学分析等。随着生命科学技术的不断发展，蛋白质组学研究技术也不断改进，使其成为解析“生命奥秘”的主要手段之一。

1.1 蛋白质组分分离技术

1.1.1 与电泳相关的蛋白质组分分离技术 作为蛋白质组分分离的经典、核心技术之一，双向凝胶电泳技术（two dimensional electrophoresis, 2DE）可以仅在一张胶图上分离上千种蛋白质，已被广泛应用于生物科学研究的多个领域[2,3]。具体来说，双向凝胶电泳主要包括两相：第一相为等电聚焦（isoelectrofocusing, IEF），主要是根据蛋白质的等电点（pI）不同而对蛋白质混合物进行初步分离；第二相为聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），主要是根据蛋白质相对分子质量（MW）的大小差异来实现对蛋白质混合物的进一步分离[4]。其中一相的等电聚焦主要通过固相PH梯度技术[5]来实现的，该技术于20世纪80年代建立起来，其所用的介质是一些弱酸或弱碱性的丙烯酰胺衍生物，形成一个稳定、连续及线性的pH梯度，可以分离等电点（pI）只差0.001pH单位的蛋白质，而且pH梯度稳定，不阴极漂移，不丢失碱性蛋白，可重复性较好。

差异凝胶电泳技术（difference gel electrophoresis，DIGE）是在双向凝胶电泳技术的基础上于1997年形成的一种新技术，其主要步骤为：①用两种不同的荧光染料花青（Cy2、Cy3或Cy5）标记不同的蛋白样品；②等量混合荧光标记后的样品；③使用相同的内标，将混合后的样品经双向凝胶电泳进行分离；④在荧光显微镜下，用不同的波长下来检测荧光。若一种蛋白在两个样品中都有，会发出两种荧光；若只存在于一种样品中，则只发出一种荧光。在进行样品蛋白质差异表达研究的时候，与经典的双向凝胶电泳相比，DIGE更好地消除了实验的偶然误差，避免了胶与胶之间的差异，提高了实验结果的可信度，不影响后续实验，而且灵敏度较高，达到0.1～0.2 μg。但是，荧光染料只能标记在赖氨酸残基上，无法标记、检测到不含赖氨酸的蛋白质。

毛细管电泳技术（capillary elect rop horesis，CE）是另外一种使用较为广泛的与电泳相关的蛋白质组分分离技术，其主要是在毛细管（内径5～10 μm）中，通过采用0～30 kV连续可调的直流高压，实现对待测混合蛋白样品按电泳迁移率、电荷和分子质量大小等差异进行有效地分离。该技术具有灵敏度高、速度快、成本低、分离范围广、样品需求量低等特点，可用于分离分子量范围不适于双向凝胶电泳技术的蛋白样品。

1.1.2 非电泳的蛋白质组分分离技术 高效液相色谱技术（high performance liquid chromatography，HPLC）产生于20世纪60年代末期，待分离的样品组分是因在互不相溶的流动相（即淋洗液）及固定相（即柱填料）中分配具有差异性而实现分离的，即：将待分离的样品制成溶液后，注入色谱柱，由于压力的作用在固定相中移动，不同样品组分会与固定相产生不同的相互作用，然后按照一定的顺序先后流出色谱柱，最后通过对检测器得到的峰信号的分析来判断待检组份所含的物质[6]。HPLC所需压力较高（150×105～350×105Pa），分析时速度快、效能高，且具有高灵敏度、高度自动化等特点。在高效液相色谱技术的基础上，又产生了双向高效液相色谱技术（2D-HPLC）、毛细管柱反相高效液相色谱技术（RP-HPLC），而且后者还可以与毛细管电泳（CE）或者毛细管等电聚焦（CIEF）等相互偶联发展成多维液相色谱技术HPLC-LC和HPLC-CIEF，从而实现对蛋白质混合物进行更好、更精确地分离[7]。

1.2 蛋白质组分鉴定技术—生物质谱 质谱（mass spectrometry，MS）技术被广泛应用到对蛋白质的鉴定中，为我们分析复杂蛋白质样品提供了较好的平台，而且质谱技术近年来取得了飞速发展，其中，最为引人关注的进展是三位研究人员（Fenn，Tanaka，Wuthrich）因将质谱及核磁共振技术应用于对生物大分子物质的分析而获得了2002年度的诺贝尔化学奖[8]。MS的基本原理为将待测样品分子离子化后，由于不同物质具有不同的离子质荷比(m/z)，根据其差异来分离并确定这些物质的分子量（Mr）。通常情况下，质谱仪主要包括离子源、质量分析器和检测器三个部分。常用的离子化方式为电喷雾离子化（ESI）和基质辅助激光解吸附离子化（MALDI），而常用的质量分析器为四级杆（Q）、飞行时间（TOF）、离子肼（IT）以及傅里叶变换离子回旋共振（FTICR），它们既可单独也可串联起来使用。基质辅助的激光解析电离—飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）方法常用于肽质量指纹图谱（PMF）技术。在PMF技术中，待测样品中的蛋白质需先用蛋白酶酶切，然后用MALDI-TOFMS对肽混合物质量进行测定而得到一套肽质量图谱，最后将该图谱与数据库中的蛋白质理论酶解肽质量图谱进行对比来对蛋白质定性。串联质谱ESI-MS/MS方法常用于肽序列标签技术（PST），在该方法中，经一级质谱产生肽段，从中选择母离子进入二级质谱，肽段经惰性气体碰撞后沿肽链发生断裂并产生了各肽段质量数值差值，通过该值推断肽段序列并进行数据库检索从而获得肽段的氨基酸序列。随着技术的不断发展，质谱技术不仅可以用于蛋白质序列的鉴定，还可用于定量蛋白质组学分析、对蛋白质翻译后修饰的研究以及用来研究蛋白质之间的相互作用。

1.3 蛋白质组生物信息学分析 生物信息学（Bioinformatics）是一门利用计算机科学技术实现对生物系统规律进行研究的学科，其研究的主要内容为基因组学（Genomics）和蛋白质组学（Promomics）两方面[9]，具体来说就是从核酸碱基序列和蛋白质氨基酸序列出发，分析这些序列中所蕴涵的生物信息。截止2006年，生物学数据库总数已达500多个，其中包含300个左右的蛋白质数据库[10]，这些数据库主要用于对双向电泳结果进行分析以及对蛋白质序列进行分析。作为蛋白质组学研究主要内容之一，基于双向电泳图片的数据库的主要特点为：数据具有直观性；在蛋白质双向电泳图片的基础上整合了蛋白质序列、结构以及功能等信息[11]。常用的该类数据库主要有：SWISS—2DPAGE、GELBANK、ECO—2DBASE、The Rice Proteome Databas、YPD等等。作为生物信息学数据库中最基本的数据库，基于蛋白质序列信息的数据库主要包括：①主要用于蛋白质序列测定的蛋白质序列数据库，包括：未经过信息纠正的蛋白质信息资源数据库PIR，具有高可信度的SWISS—PROT数据库等等；②主要用于蛋白质结构分析的蛋白质结构数据库，包括：预测蛋白质三维结构的PDB，阐明蛋白质结构与进化关系的SCOP，对PDB数据库中信息进行汇总分析的PDBsum；③主要用于蛋白质功能鉴定的蛋白质功能数据库，包括：GO分析，其从分子功能（MF）、生物过程（BP）以及细胞组分（CC）三个方面对蛋白质进行分类。KEGG由基因、通路、配体化学反应、序列相似性、基因表达以及蛋白分子相互关系六个数据库组成，帮助研究者整合基因和表达信息，使其作为一个整体网络从宏观上来进行研究。

2 日本血吸虫蛋白质组学研究进展

2.1 日本血吸虫尾蚴蛋白质组学研究 尾蚴是血吸虫生活史中唯一一个具有感染性的阶段，经射线致弱的血吸虫尾蚴免疫动物，可诱导动物产生高水平的保护性免疫力，是目前公认的诱导保护效果最高、最稳定的抗血吸虫病疫苗。

Yang 等[12]用双向电泳技术对紫外线辐照致弱日本血吸虫尾蚴及正常尾蚴的可溶性虫体蛋白分析、比较，发现部分蛋白点存在显著性差异，从中筛选出20种差异表达蛋白进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定，根据功能分为五大类，即：Actin等结构动力蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶等能量代谢相关酶类，14-3-3蛋白等信号传导通路相关分子，HSP70 家族等相关热休克蛋白，以及20 S 蛋白酶体等功能蛋白。从而在蛋白水平上为探讨紫外线辐照致弱尾蚴诱导的免疫保护机制，发现新的抗日本血吸虫病疫苗候选分子提供了新思路。

2.2 日本血吸虫童虫蛋白质组学研究 血吸虫童虫是血吸虫在终末宿主体内发育的早期阶段也是虫体发育最关键的阶段，对日本血吸虫童虫差异蛋白质组学研究，不仅有助于揭示日本血吸虫的生长发育机制，还为开拓抗血吸虫病疫苗和潜在药物靶标的研究提供了基础。

赵晓宇等[13]应用双向电泳技术和质谱技术对日本血吸虫16日龄童虫和40日龄的雌、雄成虫的可溶性蛋白进行分离、分析，获得（26±1）个童虫特异表达的蛋白斑点，对其所代表的16种蛋白进行生物信息学功能预测分析表明，这些蛋白可能与血吸虫能量代谢、生物合成、信号传导和细胞构成等相关。孙安国等[14]收集日本血吸虫尾蚴、童虫（8、19日龄）、成虫（42日龄，雌、雄虫）和虫卵，分别抽提可溶性及疏水性蛋白，双向电泳技术和质谱技术进行分离、鉴定，从中挑出22个童虫特异表达的蛋白进行生物信息学分析表明，这些蛋白主要参与细胞代谢、应激反应、生长发育等过程。洪炀[15]收集来源于易感宿主BALB/c小鼠、不易感宿主Wistar大鼠和抗性宿主东方田鼠体内的10日龄日本血吸虫童虫，应用荧光差异凝胶双向电泳技术（2D-DIGE）和MALDI-MS/MS分析、鉴定蛋白表达情况。GO分析表明：与大鼠来源10日龄童虫相比，小鼠来源10日龄童虫有27个蛋白高表达、12个蛋白低表达，这些蛋白与蛋白、糖类、RNA代谢，应激反应，蛋白转运，调节基因表达和细胞骨架蛋白有关；与东方田鼠来源10日龄童虫相比，小鼠来源10日龄童虫有13个蛋白高表达、8个蛋白低表达，这些蛋白主要涉及蛋白、RNA、糖类代谢途径，还有部分参与构成细胞骨架。通过比较三个宿主来源10日龄童虫的蛋白表达差异情况，有助于我们进一步了解血吸虫的生长发育机制。

2.3 日本血吸虫成虫蛋白质组学研究 血吸虫童虫经雌雄合抱后发育为成虫，寄居于终末宿主的门脉-肠系膜静脉系统，雌虫产卵所引起的肠、肝脏肉芽肿和纤维化是血吸虫病的主要病变，也是疾病传播的主要原因。因此，有关日本血吸虫成虫蛋白质组学的研究也较多。

2.3.1 成虫可溶性抗原蛋白质组研究 为了筛选到与免疫应答相关的特异性成虫抗原，将蛋白质组学技术与免疫印迹技术联合使用，从而为寻找日本血吸虫特异性抗原提供了新思路。郑辉等[16]用双向电泳技术分离日本血吸虫成虫可溶性蛋白，以血吸虫病患者血清为一抗，经Western blot 免疫印迹检测，鉴定到57个特异性日本血吸虫成虫抗原。Abdel-Hafeez等[17]用高效二维液相色谱分离系统（proteome PF 2D）分离日本血吸虫可溶性虫卵抗原和成虫抗原，以辐射致弱尾蚴免疫血清为一抗，经免疫斑点法筛选获得8个抗原候选分子，其中有两个蛋白能与免疫血清发生强烈反应且不能被阴性血清识别。

2.3.2 成虫性别差异蛋白质组研究 雌雄虫合抱是血吸虫发育成熟的关键，也是雌虫性成熟和产卵的前提，通过对两者比较分析获得差异表达蛋白，有助于揭示血吸虫发育机理、探索控制血吸虫雌虫成熟产卵的有效方法、以及开发新的抗生殖等疫苗候选抗原分子和药物靶标。

朱建国等[18]利用双向电泳技术对日本血吸虫雌雄虫体蛋白进行了分析比较，结果表明：雄虫只有在42 kDa、PI 5.60～5.90和28 kDa、PI 6.90～7.30两个区域表达量高于雌虫，在其它区域后者显示的特异性蛋白更多。吴忠道等[19]用双向电泳分析了日本血吸虫雌雄虫可溶性蛋白组分，两者共有的多肽斑点仅有51个，多数斑点不同，认为二者差异较大。Cheng等[20]收集虫卵、14日龄童虫、雌虫和雄虫，用顺序抽提方法获得可溶性蛋白和疏水性蛋白，利用双向电泳和质谱对雌雄虫合抱后差异表达蛋白进行分离和鉴定，二者特异表达的可溶性蛋白分别为（23±2）个、（41±4）个，疏水性蛋白分别为（26±3）个、（11±1）个，从雌雄虫中各挑出12、16个特异蛋白点进行生物信息学分析表明，这些蛋白主要参与信号传导、代谢和转录的调控等过程。袁仕善等[21]用双向电泳技术分别对日本血吸虫雌、雄成虫的可溶性蛋白和疏水性蛋白进行了分离，二者特异表达的可溶性蛋白为（255±10）个、（224±12）个蛋白点，疏水蛋白为（200±11）个、（132±8）个蛋白点。经MALDI-TOF-MS／MS对雌虫和雄虫特异表达的各10个蛋白点进行质谱分析，分别鉴定到5个和1个蛋白，与日本血吸虫的发育、生殖、营养和信号转导等过程有关。Dai等[22]利用双向电泳技术和质谱技术，对日本血吸虫雄虫在合抱与未合抱状态下蛋白质表达上的差异进行了分析，成功鉴定到二者差异表达蛋白9个，功能涉及血吸虫的生长发育、生殖、营养、运动、信号传递等过程，为揭示雌雄合抱机制提供了理论依据。

2.3.3 成虫排泄分泌物蛋白质组研究 血吸虫在终末宿主体内完成其生活史的过程中，通过体被、肠上皮表面或者是其它器官释放分泌物，经免疫模拟来干扰宿主免疫系统的攻击[23]。鉴定血吸虫排泄分泌物中的蛋白质组分，有助于我们深入了解血吸虫如何调节宿主免疫应答反应而建立慢性感染，从而发现抗血吸虫感染的疫苗候选分子，药物靶标和诊断抗原。

Liu等[24]收集日本血吸虫成虫排泄分泌物，经SDS-PAGE分离后，用LC-MS/MS鉴定得到101个蛋白点，其中包括53个分泌蛋白。深入分析显示：脂肪酸结合蛋白为其主要组成部分；热休克蛋白HSP70、HSP90和HSP97是其最大的蛋白家族，表明这些蛋白在免疫调节中起到重要作用；还有包括肌动蛋白、14-3-3、氨肽酶、烯醇化酶以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶在内的其它分泌蛋白，其中部分蛋白已经作为候选疫苗分子和治疗靶标进行研究；抗菌蛋白CAP18、免疫球蛋白、补体等7种宿主源性蛋白也被鉴定，为表明血吸虫的免疫逃避机制等提供了有价值的信息。余传信等[25]用双向电泳技术对日本血吸虫成虫排泄分泌物的蛋白质组成进行分离、分析，获得1012个蛋白点，质谱鉴定得到139种蛋白质，其中虫源性蛋白为76种，包括谷胱甘肽转移酶、抑免蛋白、硫氧还蛋白过氧化物酶等蛋白，这些蛋白主要与血吸虫生命代谢、生长发育、免疫调控相关。

2.4 日本血吸虫体被蛋白质组研究 体被不仅是血吸虫直接与宿主免疫效应分子直接基础的界面，而且不停地更新，从而导致不同发育阶段虫体体被结构和生物学功能不断改变，而这一切变化的分子基础是虫体体被蛋白的改变。所以，通过对日本血吸虫体被蛋白的研究有可能发现候选疫苗分子、新药靶标以及新诊断抗原。

Liu等[26]通过Triton X-100技术获得了日本血吸虫四个阶段（肝型童虫、雄虫、雌虫及合抱型成虫）的体被并进行了蛋白质组学分析，共鉴定获得159个肝型童虫、134个雄虫、58个雌虫以及156个合抱成虫体被蛋白。值得注意的是，合抱型成虫有85个体被蛋白并不存在于单独提取的雄虫或雌虫体被中，这可能是由于体被蛋白在分离或用质谱鉴定的过程中出现了差异。一些重要的血吸虫功能分子，在该研究中得到鉴定，比如与膜相关的Sj22.6[27]、谷胱甘肽-S-转移酶[28]、Sj14-3-3抗原[29]，以及一些细胞骨架蛋白和包括肌动蛋白、微管蛋白在内的动力蛋白等等[30]。另外，还有一些分子伴侣（60、70、86、90 kDa），维持氧还稳态的酶（如：抗氧化的硫氧还蛋白过氧化物酶和超氧化物歧化酶）以及一些Ca2+信号通路中的关键物质（卡配因、肌钙网蛋白、肌钙网蛋白A）[31,32]，后两类物质很可能在药物治疗中具有重要意义。Liu等[33]收集制备日本血吸虫尾蚴、童虫、成虫、虫卵、毛蚴、成虫体被以及卵壳样品，用2D-LC或1-DE/1-DLC和串联质谱进行分析，共鉴定到55个宿主源性蛋白。包括蛋白水解酶抑制剂、超氧化物歧化酶在内的一些宿主源性蛋白，它们可能与血吸虫抵抗宿主攻击有关。这一结果说明血吸虫在终末宿主体内寄生的过程中，通过利用后者的激素、信号分子来维持自身的生长发育及逃避宿主免疫应答，有助于探讨宿主抵抗血吸虫感染的免疫机理、血吸虫免疫逃避机制、肉芽肿的形成原因，从而加深对宿主和寄生虫相互作用机制的理解。Mulvenna等[34]应用链霉亲和素-生物素的方法提取成虫体被蛋白，酶切后经游离胶分馏器（OFFGEL）分离后，进一步用LC-MS/MS鉴定得到54个体被蛋白，包括一些葡糖糖转运蛋白，氨基通透酶和亮氨酸氨肽酶、Sm29同源物各1个，四次跨膜蛋白家族成员，以及一系列的转运蛋白、热休克蛋白和新发现的具有免疫活性的蛋白质。此外，通过使用电子显微镜对标记的体被蛋白进行观察，还发现部分膜蛋白经内化而进入连接体被细胞体和体被基质的胞质桥中，这不仅在一定程度上解释了日本血吸虫是如何躲避宿主免疫系统攻击的，而且为筛选血吸虫新药物靶标以及候选疫苗分子提供了新思路。

2.5 与药物和诊断相关的蛋白质组研究 虽然以吡喹酮为主的化学疗法是治疗血吸虫病和控制传播的重要手段之一，但是随着大规模地反复化疗会引起重复感染和抗药性等问题[35]。因此，有必要阐明药物作用机制，为新药的开发提供依据。张玲等[36]用二维-纳喷雾-液相色谱联合串联质谱（2D-nano-LC-MS／MS）技术鉴定、比较吡喹酮处理前后日本血吸虫成虫蛋白质组，共鉴定到16个药物处理前后差异表达的蛋白质，主要涉及细胞骨架、细胞应激反应、细胞间信号传导等功能，提示这些蛋白与吡喹酮的作用机制有关。曲国立等[37]收集日本血吸虫湖南株、江西株和江苏株的成虫，分别制备三者雌、雄虫的可溶性蛋白，用双向电泳技术分离，两两比较后获得14个雄虫差异蛋白点和18个雌虫差异蛋白点，从中分别选择7个、3个蛋白点进行MALDI-TOF-MS鉴定分析，结果表明这些不同地理株差异表达的蛋白可能与蛋白翻译后修饰、蛋白代谢、信号转导、细胞调控及能量代谢等过程相关，从而为了解不同地理株对吡喹酮敏感性的机制提供了基础。

目前，缺乏敏感、特异的血吸虫病诊断技术，尤其是对早期的血吸虫感染的检测技术。Zhong等[38]用二维电泳技术分离日本血吸虫成虫可溶性抗原，以血吸虫兔阳性血清为一抗进行免疫印迹分析，获得10个蛋白点进行LC/MS-MS分离、鉴定，研制了其中两个抗原SjLAP和SjFABP的重组蛋白，并以它们作为诊断抗原，应用ELISA方法来诊断人血吸虫病。结果显示：二者检测的特异性高达96.7%；二者检测急性血吸虫病感染的敏感性分别为98.1%、100%，检测慢性血吸虫病感染的敏感性为87.8%、84.7%。经吡喹酮治疗后，SjLAP和SjFABP的抗体滴度也显著性降低。因而，SjLAP和SjFABP不仅可以用于对血吸虫病的检测，还能评估药物治疗效果。Huang等[39]用日本血吸虫尾蚴感染新西兰大白兔，1周后收集阳性血清，经弱阳离子磁球处理，进一步用MALDI-TOF-MS分析。与阴性血清相比，阳性血清鉴定到7个特异性峰，将此特异性蛋白质组模型用于检测1～4周感染兔血清，有效率分别为30%，55%，75% 和80%，结果表明：在兔子实验动物模型中，MALDI-TOF-MS与磁珠分离联合使用，可以准确、快速地检测早期血吸虫感染。

3 结语

蛋白质组学一种高通量生物技术工具，已经被广泛运用到多个研究领域。目前，对日本血吸虫蛋白质组学研究还主要是对不同期别虫体蛋白质组、不同性别虫体差异蛋白质组、排泄分泌物以及部分组织和器官蛋白质组、与药物和诊断相关的蛋白质组的组分的分离，对少数组分进行鉴定，发现了一些重要蛋白质分子，但在相关蛋白组分的注释等方面有待加强。日本血吸虫基因组全序列草图已于2009年6月绘制完成[40]，这为日本血吸虫后基因组学的研究尤其是蛋白质组学提供了大量有价值的序列信息。随着蛋白质组学技术的不断改进，新方法的不断出现，日本血吸虫蛋白质组学的研究也将不断深入，为研制开发新型疫苗、药物和诊断制剂提供重要的理论基础。

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