水动力转染技术的应用进展

白 冰，赵 勇，张 海，师长宏

（第四军医大学实验动物中心，西安 710032）

将外源基因导入动物体内并获得高效表达，是分子生物学、基因功能和调节、蛋白结构和功能、基因治疗以及生物工程等研究领域前进发展至关重要的能力。这种能力甚至比人类基因组和基因克隆工程更重要。所以，迫切需要发明一种能使外源基因在活体内高效表达，以便研究基因功能，为疾病的治疗学研究打下基础。水动力转染技术作为一种简便、快速、高效的转染方法得到了广泛的应用。

1 水动力转染方法的概述

Wolff等［1］将裸质粒DNA肌肉注射在小鼠体内，首次发现在注射部位有目的基因的表达，根据Wolff最初的发现，许多实验室进行了多次类似的相关研究。证实了利用局部给药的方法将外源基因注射在小鼠体内，发现在动物肝脏［2-4］、肺脏［5］、心脏［6］和皮肤［7］等部位都表达了目的基因。虽然，应用裸质粒DNA转染不需要相应的病毒载体，省去了载体的制作过程，宿主也不会受病毒载体免疫遗传学和致瘤因素的影响，更不会有内源性病毒重组的危害［8］，但由于转基因表达水平很低，在治疗学应用上还有许多关键问题不能解决。直到1999年，Zhang等［9，10］从小鼠的尾静脉快速注射了大体积（约2～3mL）含裸质粒DNA的生理盐水后，在肝脏细胞中直接检测到了转染的基因高水平且长时间的表达。才将该方法正式命名为水动力转染法（hydrodynamics-based transfection）。

水动力转染方法是指通过一种全身给药的方法，即从小鼠的尾静脉快速注射大体积（8～12mL/100g体重）含目的基因质粒DNA的生理盐水，从而达到外源基因在小鼠体内高效表达。总之，这种方法与传统的基因转染方法相比，是一种简单、方便、高效的方法，可以在整个动物体内表达外源基因。然而此技术在人类基因治疗研究中的实用价值，一直未有相关文献报道。从此，越来越多的研究者开始验证此方法的可行性，并将其作为一种新的外源基因转染方法，广泛应用于包括目的基因治疗学活性在内等各方面的评估［11］，DNA序列调节功能的分析［12］，以及用于消除靶基因表达的RNA干扰（RNAi）的设计等许多方面［13］。试验结果证明，水动力转染技术确实是现代分子生物学领域不可或缺的一种新的基因研究手段。

2 水动力转染法在肝炎病毒实验动物模型研究中的应用进展

水动力转染方法具有很好的肝脏靶向性，所以比较适用于肝炎病毒实验动物模型及其相关的功能研究。肝炎病毒分为甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒四种，目前国际上利用水动力转染技术已经成功建立了乙、丙、丁型肝炎病毒的实验动物模型。

灵长类是乙型肝炎病毒易感种群，而其他种属的动物都不易感染HBV。所以，为了突破这种种属的障碍，2003年，Suzuki等［14］将相当于HBV基因组1.5倍长的核酸经水动力转染法导入具有免疫活性的小鼠体内，在肝脏中检测到了乙肝病毒的转录，HBV核心蛋白在约3％的肝细胞中表达。2005年，吴莹等［15］利用水动力转染方法，将1.3倍的HBV真核表达质粒（pHBV1.3）转染入小鼠体内。同时，将HBV全基因组质粒与HBV核心区的siRNA表达载体（pSI-C）一起注射入小鼠体内，做了RNA干扰治疗小鼠急性乙型肝炎病毒的实验，发现pSI-C干扰组HBsAg和HBsAg的表达均受到抑制，血清中HBsAg阴性，表明RNAi技术能特异、高效地抑制小鼠体内HBV的复制和表达，提示siRNA作为一种新型的抗病毒药物的巨大潜能。HBV实验动物模型的成功建立，为今后进行药物筛选及抗病毒治疗的研究拓展了新的思路。

有研究［16］表明：HCV RNA N端具有的内部核糖体进入位点（IRES）是反义核酸、核酶和siRNA等药物治疗的重要靶位。但是，缺乏合适的HCV感染细胞及小动物模型是目前抗HCV药物研究和开发的主要障碍之一。2002年，McCaffrey等［17］利用水动力转染技术将萤火虫荧光素酶基因和HCV IRES的融合基因从小鼠尾静脉注射入体内，观察到小鼠体内HCV IRES萤火虫荧光素酶报道mRNA翻译的实时图像，表明HCV IRES在小鼠体内是有功能的，从而建立了能用于筛选HCV IRES抑制药物的小鼠丙肝模型。

3 水动力转染技术在其他肝脏疾病研究中的应用

肝脏纤维化是一个严重威胁人类健康的问题，目前还没有任何有效的药物来治疗此病，防止纤维形成和复苏内源性修复活性是目前乃至以后治疗的一个重要策略。许多肝纤维化研究的动物试验都是用各种肝毒素感染的，但是这种方法感染的动物模型形成的肝硬化或广泛的不可逆的纤维变性比较普遍，而且不是典型的早期肝纤维化。在纤维化疾病的发展和发病机制的研究中，发现转化生长因子β1（TGF-β1）是一个25×103的多功能细胞因子，已经被证实起重要作用［18］。Yang等［19］利用水动力转染法将转化生长因子β1（TGF-β1）基因的裸质粒DNA转入小鼠体内。尽管TGF-β1的诱导作用是暂时的，但是纤维化水平没有达到较大的范围，所以此模型是一个动态的可逆的肝纤维化实验动物模型，对纤维化早期分子机制及抗纤维化药物的研究有重要意义。

4 水动力转染技术在糖尿病研究中的应用

He等［20］将胰岛素的cDNA插入在质粒载体的CMV启动子下游，通过水动力转染技术将获得的质粒转染入用STZ诱导的糖尿病小鼠体内，经过检测葡萄糖的水平、小鼠的体重、胰岛素水平、肝脏的免疫组织学和肝脏中胰岛素mRNA的转录水平，结果显示：质粒转染之后，糖尿病小鼠血浆中的胰岛素显著增加，通过免疫染色证明肝脏中的胰岛素阳性，同时血糖过多的并发症也得到改善，小鼠血中的葡萄糖降至正常水平，体重下降的症状也得到改善。而且快速的尾静脉注射没有引起任何致命损害。利用水动力转染技术，使得胰岛素基因在肝脏中得到高水平的表达，从而控制I型糖尿病的血糖并改善其症状。此方法为研究1型糖尿病基因疗法提供了一种简单而有效的途径。

5 水动力转染技术在心肌炎研究中的应用

白细胞介素-1（IL-1）是心肌炎中一个作用很重要的细胞因子，为了研究IL-1受体拮抗剂（IL-1RA）免疫球蛋白（Ig）基因在治疗试验性自身免疫心肌炎（EAM）中的作用及其机理，Liu等［21］将分别编码IL-1RA-Ig和Ig的载体质粒通过水动力转染法导入大鼠体内。在转染的第17天，通过超声心动图和血液动力学参数显示心脏功能改善，心房中促尿钠排泄的基因表达减少，及心肌炎的面积减少等各方面指标表明IL-1RA-Ig基因疗法在控制EAM中效果明显。由此说明，利用水动力转染技术成功的建立了心肌炎实验动物大鼠模型。

6 水动力转染技术在肾脏疾病研究中的应用

基因疗法是治疗肾脏疾病的一场革命。而运用基因疗法首先必须有成功的实验动物模型，在动物模型的基础上先评估基因疗法的效果，疗效明显的方能用于临床试验。由于病毒的白介素-10（vIL-10）具有多种免疫调制的特性，因此Higuchi等［22］利用水动力转染技术将表达vIL-10的质粒DNA导入已感染新月体肾小球肾炎的WK大鼠体内。实验结果中实验组大鼠的新月体形成减少、肾小球中的总细胞数、巨噬细胞和CD4+T细胞数量及尿蛋白相应的减少，肾脏异常功能的弱化等，细胞因子检测发现转染含有vIL-10质粒的大鼠肾小球内的INF-γ、TNF-α等因子水平明显低于对照组。此研究表明应用水动力转染法的vIL-10基因疗法对治疗新月体肾小球肾炎效果非常显著，为进一步研究基因疗法和开发基因药物奠定了基础。

7 水动力转染技术在抗肿瘤研究中的应用

将外源基因通过水动力转染技术导入小鼠体内，并在小鼠肝脏获得高水平的表达。在此基础上，Tsuyama等［23］为了评估TNF-α在肿瘤治疗中的效果，先用B16黑色素瘤细胞感染小鼠，再利用水动力转染技术将编码TNF-α的裸质粒DNA转染入小鼠体内。TNF-α表达的量随转染质粒中TNF-α含量的增加而增高，而TNF-α的活性在转染后9h达到峰值，之后又逐渐下降。TNF-α是一种促炎症反应的细胞因子，当其剂量达到高峰时对治疗效果起到关键性作用。此研究也显示了水动力转染技术有操作简单、转染效果明显的优势，在癌症的基因治疗研究中显示了不可替代的优越性。

在各种免疫治疗途径中，白细胞介素12（IL-12）因其占有优势的抗肿瘤作用而备受瞩目。但是由于INF-γ的超常诱导，使得IL-12治疗具有严重的副作用。为了优化其治疗效果并降低副作用，Wang等［24］通过水动力转染技术，将IL-12和粒性白细胞-巨噬细胞菌落刺激因子（GM-CSF）的结合基因转染入小鼠体内，显示IL-12和GM-CSF诱导了很强的抗癌抗菌素细胞免疫力，获得了对鼠科动物肝细胞癌的显著治疗效果。

8 水动力转染技术应用的前景

水动力转染方法为研究者在整个动物体内进行基因表达的调控、基因表达产物功能的分析提供了一个便利的工具，尤其是越来越多地应用于许多种遗传性和后天获得性疾病的分子机制方面的研究。另外，这种方法可以为建立很好的细菌蛋白表达系统提供帮助；从人类基因组中新发现了越来越多的基因，需要对这些基因的功能进行研究，而水动力转染技术也对此非常有用［25］。

总之，水动力转染技术作为一种比较成功的、简单、快捷、高效的转染方法，会被越来越多地应用于科学研究。

［1］Wolff JA，Malone RW，Williams P，et al.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo［J］.Science，1990，247（4949 Pt1）：1465-1468.

［2］Hickman MA，Malone RW，Lehmann-Bruinsma K，et al.Gene expression following direct injection of DNA into liver［J］.Hum Gene Ther，1994，5：1477-1483.

［3］Zhang GE.Expression of naked plasmid DNA injected into the afferent and efferent vessels of rodent and dog livers［J］.Hum Gene Ther，1997，8：1763-1772.

［4］Budker V，Zhang G，Knechtle S，et al.Naked DNA delivered intraportally expressesefficiently in hepatocytes［J］.Gene Therapy，1996，3：593-598.

［5］Meyer KB，Thompson MM，Levy MY，et al.Intratracheal gene delivery to the mouse airway：characterization of plasmid DNA expression and pharmacokinetics［J］.Gene Therapy，1995，2：450-460.

［6］Li K，Welikson RE，Vikstrom KL，et al.Direct gene transfer into the mouse heart［J］.J Mol Cel Cardiol，1997，29：1499-1504.

［7］Choate KA，Khavari PA.Direct cutaneous gene delivery in a human genetic skin disease［J］.Hum Gene Ther，1997，8：1659-1665.

［8］Ishida T，Li W，Liu Z，et al.Stimulatory effect of polyethylene glycol（PEG）on gene expression in mouse liver following hydrody namics-based transfection［J］.J Gene Med，2006，8（3）：324-334.

［9］Zhang G，Budker V，Wolff JA.High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA［J］.Hum Gene Ther，1999，10（10）：1735-1737.

［10］Liu F，Song Y，Liu D.Hydrodynamics2based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA［J］.Gene Ther，1999，6（7）：1258-1266.

［11］Liu D，Knapp JE.Hydrodynamics-based gene delivery［J］.Curr Opin Mol Ther，2001，3：192-197.

［12］Kramer MG，Barajas M，Razquin N，et al.In vitro and in vivo comparative study of chimeric liver-specific promoters［J］.Mol Ther，2003，7：375-85.

［13］Song E，Lee SK，Wang J，et al.RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis［J］.Nat Med，2003，9：347-351.

［14］Suzuki T，Takehara T，HayashiN，et al.Intravenous injection of naked plasmid DNA encoding hepatitis B virus produces HBV and induces humoral immune response in mice［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，300（3）：784-788.

［15］吴莹，黄爱龙，唐霓，等.应用RNA干扰治疗小鼠急性乙型肝炎病毒感染［J］.中华医学杂志，2005，85（9）：630-634.

［16］Jubin R.HepatitisC.IRES：translatingtranslation intoa therapeutic target［J］.Curr Opin Mol Ther，2001，3（3）：278-287.

［17］McCaffrey AP，Meuse L，Pham TT，et al.RNA interference in adult mice［J］.Nature，2002，418（6893）：38-39.

［18］Gouville AC，Boullay V，Krysa G，et al.Inhibition of TGF-β signaling by an ALK5 inhibitor protects rats from dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis［J］.Br J Pharmacol，2005，145：166-177.

［19］Yang KL，Hung KC，Chang WT，et al.Establishment of an early liver fibrosis model by the hydrodynamics-based transfer of TGF-β1 gene［J］.Comp Hepatol，2007，6：1-9.

［20］He CX，Ding S，Wu WJ，et al.Insulin expression in livers of diabetic mice mediated by hydrodynamics-based administration［J］.World J Gastroenterol，2004，10（4）：567-572.

［21］Liu H，Haruo H，Tsuyoshi Y，et al.Effect of hydrodynamicsbased gene delivery of plasmid DNA encoding interleukin-1 receptor antagonist-Ig for treatment of rat autoimmune myocarditis possible mechanism for lymphocytes and noncardiac cells［J］.Circulation，2005，111：1593-1600.

［22］Higuchi N，Maruyama H，Kuroda T，et al.Hydrodynamicsbased delivery of the viralinterleukin-10 gene suppresses experimental crescentic glomerulonephritis in Wistar-Kyoto rats［J］.Gene Therapy，2003，10：1297-1310.

［23］Youichi T，Masayuki K，Naoko MK，et al.Anti-tumor effects of naked plasmid DNA using a hydrodynamics-based procedure［J］.Nucleic Acids Symposium Series，2004，48：239-240.

［24］Wang Z，Qiu SJ，Ye SL，et al.Combined IL-12 and GM-CSF gene therapy for murine hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Gene Therapy，2001，8（10）：751-758.

［25］Liu F，Song YK，Liu D.Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA［J］.Gene Therapy，1999，6：1258-1266.