MicroRNA在阿尔茨海默病发病机制中的作用

梁春联，秦 川

（中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021）

阿尔茨海默病（A lzheimer＇s disease，AD）是一种以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的神经退行性疾病。主要病理特征为皮质神经元数量减少，神经纤维缠结（neurofibrillary tangle，NFT），老年斑沉积（senile plaque，SP）等。

miRNA是一类长约22个核苷酸的内源性小分子RNA，由基因组转录生成。迄今为止，已鉴定的miRNA多达上千种（miRBase version 13.0，http：// m iRNA.sanger.ac.uk），调控机体约90％以上的基因表达，据推测，人体组织细胞内的每一个生理过程几乎均受miRNA的调控［1］。miRNA调控紊乱可能是人体多种疾病发生的潜在因素，其中，m iRNA在神经生物学及神经退行性疾病中的作用也日益为研究人员所关注，本文就m iRNA与神经退行性疾病AD发生的相关研究进展做一综述。

1 miRNA的生物合成

miRNA编码基因在基因组中有多种存在形式：单拷贝、多拷贝或基因簇等。在哺乳动物体内，80％的miRNA位于基因的内含子区，而这些基因大多由RNA聚合酶Ⅱ聚合生成，因此，RNA聚合酶Ⅱ相关的转录因子参与调控m iRNA的时空特异性表达模式。此外，还有一些miRNA位于基因间隔区，其转录活化由自身的启动子介导。m iRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ转录生成原始转录本 miRNA（prim iRNA），在细胞核内pri-miRNA经属于RNaseⅢ家族Drosha酶剪切生成长度约70nt核苷酸的发夹前体m iRNA（pre-miRNA），随后pre-m iRNA被核转运受体exportin-5由细胞核运送至胞浆，后在Dicer酶的作用下，被切割成19～23 bp的成熟的miRNA，成熟的m iRNA同RNA沉默诱导复合物（RISC）结合，通过不完全互补配对作用于mRNA的3＇UTR区，抑制mRNA的翻译或促使其脱腺苷酸化而加速降解。经数据库预测，一种m iRNA可调控上百种靶基因的表达，反之，一种 mRNA也可同时接受若干种miRNA的协同调控。此外，miRNA尚可调控转录因子及与其前体pre-miRNA剪切相关的蛋白质的表达，从而在m iRNA与其靶基因之间形成一个反馈调控机制，由此可见机体 miRNA调控网络的复杂性［2］。

2 m iRNA在神经系统中的功能

人和啮齿类动物的脑组织富含miRNA的表达，相对于其它器官而言，脑组织中表达的miRNA种类更多，水平也更高。Sempere等［3］通过 Northern杂交发现了小鼠及人脑中特有的 m iRNA：miR-9，-124a，-124b，-135，-153，-183，-219。小鼠及人脑中富含的7种miRNA：miR-9，-125a，-125b，-128，-132，-137，-139，然而，人和老鼠胎脑的m ir表达模式可能有所不同。

脑miRNA的表达受到精细的调控，在脑发育过程中，m iRNA的表达有一定的时序性。如：Mir-9，-125b，181a在胚胎发育初期低表达，随着发育过程的演进表达增加，在出生后逐渐减少。此外，脑组织不同类型细胞有着不同的miRNA表达谱，如：有些m iRNA（m iR-124，m iR-128）在神经元细胞中优势表达，有些miRNA（miR-23，miR-26，miR-29）仅在星形胶质细胞中或少突胶质细胞中高表达［4］。miRNA在胚胎脑组织发育中的作用已得到了充分证实，早期即通过Dicer酶缺失突变体证实了m iR-430家族在斑马鱼及小鼠脑组织形态发生中起着重要作用［5］。

随着研究的进展，miRNA在神经系统中的的作用进一步得到了细化，而对某种特异性miRNA生理功能的深入研究也逐步显示出miRNA与神经退行性疾病的潜在相关性，如：miR-134可影响树突棘的形成［6］，m iR-124、m ir-132与轴突的生长有关［7，8］，而轴突生长不良及突触结构的丧失均为AD发生的早期事件。此外，m iRNA还参与细胞周期及凋亡的调控［9，10］，而AD患者脑内神经元的丢失与细胞周期紊乱及凋亡水平的增加紧密相关。另Lukiw［11］等还发现AD患者脑内m ir-146a表达增加与其体内炎症及应激反应有关。由此可见，miRNA可能通过多条途径影响AD的发生与发展。

3 AD患者脑内m iRNA表达谱的改变

早期对miRNA在神经退行性疾病中的作用主要是通过缺失Dicer的细胞或动物模型进行的，如：敲除Dicer酶的小鼠海马树突棘可发生与AD相似的变化［12］。然而，敲除 Dicer是一种很粗略的实验方法，因为其可导致细胞内所有miRNA成熟障碍，此外，敲除 Dicer的动物模型所呈现出的表型不仅仅是m iRNA缺失的后果，因为除m iRNA的剪切成熟之外，Dicer还有其它的功能，如：参与小干扰RNA的合成、维持异染色质结构等。但这些研究结果至少表明脑内m iRNA调控网络的异常是神经退行性疾病发生的一个潜在因素。

鉴于肿瘤发生中m iRNA表达谱研究所取得的重大收获，众多科研人员也展开了对散发性AD患者脑内 miRNA表达谱的研究。Lukiw等［13］使用DNA芯片及Northern杂交的方法对胚胎、健康成年人及 AD患者脑内海马区12种脑组织相关的miRNA的表达进行了分析，结果发现AD患者脑内miR-9，miR-125b，miR-128的表达升高，而miR-124a的表达降低。之后，Hebert［14］等对同龄对照及散发性AD患者大脑颞叶皮质区miRNA的表达进行了检测，结果显示AD患者脑内有13种miRNA的表达显著降低，经数据库比对后发现在这13种m iRNA中，有 7种具有与 AD相关的靶基因，即： m ir-15a，29b-1，9，19b与BACE1的3＇UTR有结合位点；mir-let-7，101，15a.106b与 APP3＇UTR有结合位点；m ir-9与PS 1的3＇UTR有结合位点。

对AD患者疾病早期脑及脑脊液中miRNA表达谱的分析显示，除已知的作用机制外，miRNA还可通过一些新的途径来影响AD的发生，如：氧化应激、胰岛素抵抗、天然免疫等。研究发现［15］，AD患者海马区 mir-423的表达上调，小脑 mir-98的表达下调，而这两种 m iRNA均可调控异柠檬酸脱氢酶（IDH2）的表达，IDH2表达的降低与氧化应激的耐受性有关，这部分说明了脑不同部位对AD病理损伤的易感性（AD的病理损伤主要发生在海马、皮质和皮质下区，而小脑相对较轻）。另外，该研究还发现在AD患者脑脊液中有6种m iRNA呈差异性表达，这提示miRNA有望成为疾病诊断的一种新的生化标记。目前，对患者脑脊液中 Aβ、总tau蛋白及磷酸化tau蛋白等分子的含量的检测表明其具有高度的可重复性，然而，miRNA能否同上述指标一起作为AD早期诊断的分子标记物，尚有待进一步的研究。

最近，有研究人员通过芯片对AD患者大脑皮质m iRNA及mRNA的表达谱同时进行了检测［16］。在差异表达的miRNA及mRNA中，有些miRNA与靶基因 mRNA负相关，这些 m iRNA多参与调控RNA的剪切及翻译延长。而意外的是有些参与调控碳水化合物、脂肪酸代谢以及蛋白质重构的m iRNA的表达与其靶基因mRNA的表达呈正相关，这与传统的m iRNA对靶基因的负调控作用相悖，然而，结合细胞周期阻滞时miRNA可活化靶基因表达的报道［17］，研究人员推测 m iRNA对靶基因的活化作用可能不仅是促进其翻译，还可能与增强mRNA的稳定性有关。这些研究拓展了人们对m iRNA功能的认识，说明了在不同的细胞状态和不同生理病理环境下miRNA可能具有不同的调节作用。2010年另有篇文献报道［18］对早期 AD患者颞叶皮质区灰质和白质miRNA的表达谱分别进行了检测，并对差异表达的m iRNA与AD病理特征-神经纤维缠结及老年斑的相关性进行了对比分析，表明灰质区一系列miRNA（如：mir-15，107及mir-29家族）的下调与老年斑的数量紧密相关，即：灰质miRNA的异常表达可能是导致AD病理改变的因素之一。

综上，迄今为止尽管已有多篇文献报道AD患者脑内miRNA表达谱的改变，然而，其结果之间缺乏一致性。这归因于在脑m iRNA表达谱的分析中，技术方法的重要性，如：组织标本的来源、处理、病理损伤的程度、RNA的分离、芯片检测技术及后续的数据分析等。需注意的事项有：①取材部位，脑组织由多种细胞类型构成，而不同细胞类型中miRNA的表达谱不同，因此，取材差异会导致标本的细胞成分发生变化从而影响试验结果的可靠性；②标本来源，需注意女性患者和男性患者的疾病特征及 miRNA表达谱均有不同。③操作过程中miRNA的降解也是需要考虑的重要因素。

4 m iRNA调控AD致病基因的表达

至今，已有多篇文献报道 BACE1的表达受miRNA的调控。Wang等报道［19］，与同龄对照相比，AD患者脑内mir-107的水平显著降低，此外，他们检测到在BACE1 mRNA的3＇UTR区存在有mir-107的结合位点，在疾病进展中，随着 m ir-107的降低，BACE1蛋白水平呈增高趋势。同年，Hebert［14］也报道发现mir-29a，mir-29b-1，mir-9能够在体外调节BACE1的表达、β内分泌酶的活性及Aβ肽的产生。对临床伴有BACE1蛋白水平异常增高的 AD患者脑内 mir-29a，mir-29b-1的检测发现其表达显著降低。值得注意的是上述两项研究均表明： miRNA的降低并不与脑组织特定区域的疾病易感性相关，即：AD患者脑内运动皮层区m ir-107的表达、小脑mir-29a/b的表达也是减少的，这说明虽然这两种m iRNA降低可诱发BACE1高表达，但其并非导致脑特定区域对疾病易感的因素。Boissonneault等［20］通过细胞试验证实 mir-298、mir-328也可调控BACE1的表达，而AD模型小鼠海马区miRNA的检测结果显示mir-298、mir-328的表达降低，表明其抑制作用的丧失是导致BACE1蛋白表达增加的因素之一。

除BACE1外，APP也是m iRNA靶向调控分子之一。据数据库预测分析，APP mRNA3＇UTR区存在多个miRNA的潜在结合位点。研究表明［21］m iR-106a，miR-520c可负向调控APP的表达，细胞水平实验表明，miR-106a，miR-520c过表达时可使 APP蛋白水平降低约 50％左右。另有研究报道［22］，miR-106b也可调节APP的表达，同时，该研究人员还发现AD患者颞叶皮质区m iR-106b的表达降低可能为AD发病的诱因之一。最近，有文献报道［23］mir-101可调控APP的表达，原代培养的海马神经元细胞试验表明，m ir-101的表达与 APP蛋白水平负相关，并证实其可能为炎性细胞因子 IL-1B影响APP蛋白水平的机制之一。同时，对 AD模型鼠（SAMP8）的研究发现其 mir-16的表达显著降低［24］，体内外试验均表明mir-16高表达可显著降低APP的蛋白水平，表明模型鼠体内 APP的聚集与m ir-16的表达降低相关。

值得注意的是，尽管目前对于m iRNA在AD发病机制中作用的探讨已取得了一定的进展，但相关方面的研究还存在有一定的局限性：1）动物模型在疾病发病机制中的研究具有重要的价值，然而鉴于人体功能的特异性及复杂性，其结果并不能直接类推到人体内。2）每种m iRNA可靶向调控多种基因的表达，集中研究针对一种靶基因的作用虽有利于研究工作的进行，但这无疑忽视了m iRNA改变后的总体效应，即：上百种靶蛋白表达的改变，而这些改变的靶蛋白如何协同调控机体的功能尚有待进一步的研究。3）组织细胞内同时表达有多种miRNA，这些m iRNA协调一致共同发挥作用，聚焦单一m iRNA的作用就如同针对单一靶蛋白研究一样，会混淆其生物效应的真实性。4）目前研究中多通过转染使细胞高表达某种miRNA，继而研究其功能，然而，人为的高表达miRNA会使其与细胞内源性表达的 m iRNA发生竞争（如：使内源性 m iRNA与RISC的结合几率降低），导致内源性miRNA靶基因的表达增加。

此外，在研究m iRNA在AD发病机制中作用时，还有问题尚需探讨：导致AD患者脑内miRNA异常表达原因是什么?其改变是疾病发生的诱因还是继发事件?研究人员推测其合理的解释有两方面：1）随着机体的老化及功能状态的减退，m iRNA的合成及加工成熟发生障碍，miRNA表达水平改变成为疾病的诱发因素。2）其它始动因素导致疾病的发生，神经元毒性蛋白生成并影响miRNA的表达，继而其靶蛋白表达发生改变（如：APP、BACE1），而反过来，靶蛋白含量的改变又可进一步影响m iRNA的表达，从而形成恶性循环促进疾病的演进及发展。

Lukiw等［25］通过实验对这一推论给与了验证：用硫酸铝铁处理原代培养的神经元细胞，诱导细胞ROS的产生。7天后对细胞中m iRNA进行分析，结果发现，在产生ROS的细胞中出现一系列表达上调的miRNA：miR-9、miR-125、miR-128，而如前所述这些m iRNA在AD脑中表达上调。这一发现说明氧化应激可通过改变miRNA的表达来影响神经系统的功能和退行性变的发生。最近，又有文献报道［26］Aβ肽可影响细胞及体内m iRNA的表达。将原代培养的小鼠海马神经元细胞经 Aβ肽处理后，检测其miRNA的表达，结果发现47％的miRNA表达降低，18％的 miRNA表达增加，其中，下调最显著的m iRNA的表达（m ir-409-3p、361、20b、181c、148b）可降低4倍左右，而对 APP23模型鼠海马区miRNA的检测也在体内证明了这一点。

结语及展望

随着研究的进行，新的m iRNA不断的被分离鉴定出来，对已鉴定的m iRNA在神经系统发育、正常功能及疾病状态时表达模式的研究将具有重要的意义。而鉴于脑组织的多细胞类型成分及解剖和功能结构域的复杂性使得这一工作的开展具有一定的难度，但联合使用原位杂交及其它技术（如免疫组化）来鉴定细胞类型及组织区域表达方式可望为其提供帮助。

鉴于miRNA在AD发病机制中作用的逐步揭示，通过寡核苷酸抑制或高表达miRNA有望成为疾病治疗的新途径，然而，其实际应用尚面临着一定的挑战：1）一种miRNA可在多大程度上调控哪些蛋白的表达有待探讨；2）细胞内miRNA自身的表达调控及反馈调控机制尚不明了；3）如何克服血脑屏障在脑内抑制或高表达miRNA有待新的技术支持，此外，相关的生物利用度及毒性也是需要考虑的问题。

基于miRNA在神经系统发育、分化及突触生成等方面的研究成果，miRNA在AD中的研究价值日益凸显，筛选与疾病相关的m iRNA及其靶基因和相应的蛋白表达的改变仍将是该领域的研究焦点。随着年龄的老化及细胞分裂的进行，机体m iRNA的合成、代谢及功能也有可能会发生一系列的变化，而对这一过程的深入了解将有助于其在AD等老年性疾病中作用的探讨。此外，基因3＇UTR区的多态性也可能与AD患者脑内Aβ肽聚集等病理变化相关，因为 3＇UTR的多态性有可能会增加或减少miRNA的靶向作用位点，因此，进一步鉴定致病基因（如：APP等）3＇UTR区m iRNA结合位点的遗传多态性将有望为AD发病机制提供新的诠释。

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