荧光素酶标的人肝癌细胞裸鼠异种移植瘤模型的生物发光成像和PET-CT成像比较

李小颖，高 凯，董 伟，张连峰，2

(1.中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021;2.国家中医药局人类疾病动物模型3级实验室，北京 100021)

荧光素酶标的人肝癌细胞裸鼠异种移植瘤模型的生物发光成像和PET-CT成像比较

李小颖1，高 凯1，董 伟1，张连峰1，2

(1.中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021;2.国家中医药局人类疾病动物模型3级实验室，北京 100021)

目的 利用荧光素酶基因标记的人肝癌细胞株BEL-7402建立裸鼠肝原位移植模型，及小鼠肝原位移植模型的生物发光和小动物PET-CT成像的比较。方法 构建表达荧光素酶基因的真核表达载体并将其转入人肝癌细胞BEL-7402，经梯度浓度G418筛选获得稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆并扩大培养。BALB/cA-nu裸鼠肝门静脉接种5×105个发光细胞使其成瘤，活体荧光成像和小动物PET-CT成像系统观察肿瘤的生长情况。结果 获得了稳定表达Luc的人肝癌细胞株，将其接种到裸鼠体内，活体荧光成像系统观察发现能够成瘤，小动物PET-CT影像观察发现小鼠肝脏边缘对18F-FDG有高摄取区域。结论 利用荧光素酶基因标记的人肝癌细胞BEL-7402成功建立了原位肝癌裸鼠模型，小动物活体成像结合小动物PET-CT技术为原位肿瘤模型的建立提供了一种新的可靠的技术，为进一步研究肝癌生长转移机制和药物开发提供了新的有用工具。

人肝癌细胞;肿瘤模型;荧光素酶;生物发光成像;小动物PET-CT

人肝癌BEL-7402细胞株是1974年从临床肝癌手术标本中建立的，细胞群体倍增时间为20 h，细胞形态呈上皮样细胞，在电子显微镜下亦显示上皮细胞所具有的桥粒和张力原纤维，与临床肝癌细胞相似，分瓶培养第4天时，其有丝分裂指数约为7%。BEL-7402细胞的染色体数为不足三倍体，有一个异常的近端着丝点染色体，间接免疫荧光法测 BEL-7402细胞内的 AFP为阳性反应，LDH同工酶谱显示与成年人肝细胞不同，而与人胚肝及临床肝癌相近。目前国内外学者主要集中于不同抗肿瘤药物体外抗肿瘤作用和机制的研究［1～5］。

本实验利用萤火虫荧光素酶基因标记人肝癌细胞BEL-7402，并建立表达荧光素酶的原位肝癌裸鼠模型，利用生物发光成像技术对此模型内的肿瘤生长进行非侵入性的连续监测。同时评价了生物发光成像和小动物PET-CT成像在裸小鼠肝原位移植模型建立中的作用，为肝癌生长转移机制的研究和药物开发提供了新的有用工具。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器：人肝癌细胞BEL-7402冻存于本实验室，L-谷氨酰胺(GIBCO公司)、双抗(GIBCO公司)、DMEM(GIBCO公司)、胎牛血清(GIBCO公司)、G418(AMRESCO 公司)、脂质体 2000(Invitrogene公司)。活体荧光影像系统(I.C.E.，日本Roper公司)、倒置显微镜(Nikon TS100)。18FFDG由中国原子能科学研究院提供。PET成像系统为德国西门子INVEON PET/CT影像系统。PET系统采用64块LSO(硅酸镥)晶体，PET轴向视野为(FOV)12.7 cm，轴向分辨率距中心1 cm处小于1.7 mm。时间分辨率小于1.5 ns。CT球管电压为80 kV，球管电流为 400 μA，曝光时间为 300 ms，，CT校描时间约8 min，PET发射扫描10 min，PET重建时使用CT数据进行衰减校正。

1.1.2 实验动物：BALB/cA-nu裸小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司［SCXK(京)2007-0001］，鼠龄5周，体重15～18 g，在本实验室无特定病原体(specific-pathogen free，SPF)的饲养间饲养。所有实验操作程序均经过实验动物研究所实验动物使用管理委员会批准(批准号为GC-09-2001)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素，100 μg/mL链霉素的 DMEM培养基作为BEL-7402细胞的培养液，于5%CO2，37℃细胞培养箱内常规培养。

1.2.2 构建带有筛选标记的载体：pCAGGS-Neo-Luc由本实验室构建，用 PCR的方法从质粒pcDNA3.1(+)中扩增neo基因片段，同时在两端引入酶切位点 XhoⅠ;从质粒 pGL3中用 EcoRⅠ和XbaⅠ切取Luc基因片段，之后分别将neo基因片段和Luc基因片段重组进含有chicken β-actin启动子的载体pCAGGS中。

1.2.3 细胞转染和筛选：采用脂质体2 000转染BEL-7402细胞(具体转染步骤参照脂质体2 000操作说明)。转染后24 h，用含 1 000 μg/mL G418的培养液筛选细胞，直至形成肉眼可见的单克隆，挑取单克隆于96孔板，于5%CO2，37℃细胞培养箱内培养，汇合度达70% ～90%后，传代(1∶2传代)，取其中一块96孔板加入适量底物luciferin后进行生物发光检测，选择其中高表达的克隆株扩大培养。

1.2.4 裸鼠肝癌原位移植模型的建立和活体荧光观察：收集处于生长对数期的转染细胞，稀释至2×106cells/mL。取250 μL细胞悬液进行肝门静脉接种，共接种3只。每隔一周观察一次，连续观察四周，观察前每只裸鼠腹腔注射荧光素底物(1.5 mg/10 g)，饱和三溴乙醇(0.18 mL/10 g)麻醉后放入活体荧光影像系统摄像，Slide Book 4.0软件进行分析。

1.2.5 小动物PET-CT影像学观察：实验前6 h禁食禁水。将小鼠放入吸气室内通过吸入混有2%异氟烷的纯氧实施麻醉。麻醉完全后，通过尾静脉弹丸式注射约7.4 MBq(200 μCi)的放射性示踪剂18FFDG。然后将小鼠俯卧位固定于扫描床，使小鼠头部长轴和扫描器长轴平行且位于扫描器视野内。18F-FDG摄取45 min后进行10 min PET图像采集。PET采集完成床板移至CT机架视野中心，进行约8 min的采集。在此过程中通过面罩持续吸入在1 L/min的纯氧环境2%异氟烷维持麻醉状态。

1.2.6 肿瘤组织的病理形态学观察：肿瘤生长4周后，断颈处死小鼠并解剖，暴露肝脏，取肿瘤部位制成石蜡切片并进行H-E染色。

2 结果

2.1 稳定高表达Luc的单克隆细胞株

利用chicken β-actin系统表达性强启动子建立了带有筛选标记的表达载体pCAGGS-Neo-Luc(图1A)，将质粒转染细胞后，形成的单克隆进行成像，成像前10 min，在96孔板内加入用 DMEM配置的底物luciferin(1 mg/mL)20 μL，放入活体荧光影像系统摄像15 min，Slide Book 4.0软件进行分析(图1B)。如图2箭头所示，选取高表达Luc的克隆株扩大培养并接种裸鼠。

2.2 Luc标记 BEL-7402小鼠肝癌原位肿瘤模型的动态观察和小动物PET-CT影像学观察

将对数生长期的Luc标记BEL-7402肿瘤细胞悬液经肝门静脉接种于3只 BALB/cA-nu小鼠，细胞密度5×105cells/只。分别在接种的 7、14、21和28 d观察肿瘤的生长情况(封2图2A～D)。在接种的第7天，就可以观察到肿瘤发光，第14天时肿瘤的发光强度较第7天时变弱，推测细胞悬液在第14天时才成瘤。14 d后，随着观察天数的增加，肿瘤的体积和发光强度增强，且具有很好的线性关系。

肿瘤接种28 d后，经小鼠尾静脉注入18F-FDG后行 MicroPET-CT显像，发现小鼠肝脏边缘有约0.3 cm×1.6 cm带状高摄取区域(封2图2E)。

2.3 肿瘤组织的病理形态学观察

肿瘤生长4周后，断颈处死小鼠并解剖，暴露肝脏，发现肝脏上有灰白色的肿瘤组织，表面呈结节状，质地较硬，独立或弥漫分布在肝表面和肝边缘处，部分结节可融合成较大的结节(彩插1图3A)。

H-E染色肝脏内见多个大小不等肿瘤病灶，肿瘤边界较清楚，瘤细胞呈巢状分布，有纤细的纤维组织分隔，肿瘤细胞大小较一致，胞质红染，核圆形或椭圆形，染色深，核分裂多见(彩插1图3B)。

3 讨论

目前在模型动物体内进行活体成像主要依赖于荧光与生物发光两种技术。荧光发光需要激发光使得荧光基团达到较高的能量水平，然后发射出较长波长的发射光，但是生物体内很多物质在受到激发光激发后，也会发出荧光，产生的非特异性荧光会影响到检测灵敏度。特别是当发光细胞深藏于组织内部，则需要较高能量的激发光源，也就会产生很强的背景噪音。生物发光成像相对于荧光成像，其灵敏度高。作为体内报告源，生物发光较之荧光的优点之一为不需要激发光的激发，它是以酶和底物的特异作用而发光，且动物体自身不会发光，这样生物发光具有极低的背景。虽然荧光信号远远强于生物发光，但极低的自发光水平使得生物发光的信噪比远远高于荧光。生物发光成像技术可以观测活体模型动物体内肿瘤的生长、转移及对药物的反应［6～8］，是研究肿瘤发展及抗肿瘤药物筛选和评价的新兴手段。

正电子发射断层显像技术(positron emission tomography，PET)，是利用正电子核素标记的示踪剂进行活体显像，能够无创伤地、动态地、定量地从分子水平观察活体生理生化变化特点的一种定量显像技术。是目前最成熟的分子影像技术。小动物PET是基于PET临床诊断技术发展起来的专门用于小动物的断层显像装置，它具有灵敏度高，可定量以及实验结果可直接类推至临床等优点，因而受到了广大研究者的重视。最新的技术将PET与CT结合起来成为 PET-CT，PET-CT是将PET提供的组织细胞代谢显像及在受体大分子、蛋白质、核酸基础上进行的分子影像和CT提供的反映组织解剖结构、血流灌注的显像有机地结合在一起的最新的影像设备。PET-CT实现了从单一的形态学诊断进到功能与形态相结合的多角度的综合影像诊断的飞跃，形成一种全新的影像学，解剖-功能影像学。

18F-氟代脱氧葡萄糖(18F-nuorodeoxyglucose，18F-FDG)是目前临床上应用最多的肿瘤代谢显像剂。绝大多数恶性肿瘤细胞具有高代谢特点，葡萄糖为组织细胞能量的主要来源之一，恶性肿瘤细胞的异常增殖需要葡萄糖的过度利用，其途径是增加葡萄糖膜转运能力和糖代谢通路中的主要调控酶活性。恶性肿瘤细胞中的葡萄糖转运信息核糖核酸(mRNA)表达增高，导致葡萄糖转运蛋白增加。因此，肿瘤细胞内可积聚大量18F-FDG，经PET显像可显示肿瘤的部位、形态、大小、数量及肿瘤内的放射性分布。

本实验利用萤火虫荧光素酶基因标记人肝癌细胞BEL-7402，获得稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆，经过多次传代表达水平稳定，标记细胞的形态、生长方式、生长速度及致瘤能力等与未转染细胞无明显差异，可以反映 BEL-7402肿瘤细胞生物学行为的标记细胞，其他标记细胞的研究报道也证实了类似的结果［9］。将其经肝门静脉接种裸鼠，用活体荧光成像系统连续观察，发现能够成瘤，并且肿瘤的体积与发光强度有相关性。同时对此模型进行小动物PET-CT影像学观察，发现小鼠肝脏边缘对18F-FDG有约0.3 cm×1.6 cm带状高摄取区域。另外解剖学观察及肝脏组织病理形态学分析，进一步验证了该方法的可行性。小动物活体成像和小动物PET-CT成像技术对肿瘤动物模型微小病灶的检测灵敏度极高，能够进行无创、实时、动态的动物活体观察，从而对同一实验对象进行不同时间点的观察，减少实验动物个体间差异，与传统的实验方法相比，可以大大减少动物的用量，符合替代、减少、优化的“3R”原则，已成为广泛应用于医学、生物学及药物开发等研究领域。小动物活体成像具有比小动物PET-CT成像技术操作简单，灵敏度高，特异性好，无放射性，价钱便宜等优点。但是小动物活体成像只观察肿瘤细胞的多少与体积变化，不能实现对精确定位的要求，只要细胞活着就可以观察到，而不考虑细胞的生存状态和代谢能力以及活跃程度。小动物PET分辨率较小动物活体成像明显提高，实现了在活体上非侵入性分子水平显像，结合小动物CT实现了图像融合，达到了对精确定位的要求［10，11］。然而18F-FDG是非特异性肿瘤显像剂，除肿瘤外，正常组织可生理性摄取，一些良性病变也可摄取，容易出现假阳性和假阴性显像［12，13］，另外有放射性，价钱昂贵。

综上，利用萤火虫荧光素酶基因标记的人肝癌细胞 BEL-7402成功建立了原位肝癌裸鼠模型，小动物活体成像结合小动物PET-CT技术为原位肿瘤模型的建立提供了一种新的可靠的技术，为进一步研究肝癌生长转移机制和药物开发提供了新的有用工具。

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Comparison between Bioluminescent Imaging and Small-animal PET-CT in Xenotransplantation Tumor Model with Luc-expressing Cell

LI Xiao-ying1，GAO Kai1，DONG Wei1，ZHANG Lian-feng1，2
(1.Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Heath，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China;2.Key Laboratory of Human Diseases Animal Model State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China)

Objective To establish hepatic carcinoma mouse model with human BEL-7402 cells expressing luciferase and to compare bioluminescence imaging with that by small-animal PET-CT.Method The vector containing luciferase gene was constructed and transfected into human BEL-7402 liver tumor cell line and selected with G418 to obtain stable Luc-expressing clones.5×105cells，constitutively expressing luciferase，were inoculated to liver of BALB/cA-nu through hepatic portal vein for assessment of tumor growth with the whole-body optical imaging system and small-animal PET-CT.Result The stable Luc-expressing BEL-7402 cell lines were abtained，which could grow to tumor mass after implantation.There was high uptake of18F-FDG at the edge of liver with small-animal PET-CT.Conclusion Luc-labeled BEL-7402 cell lines and a mouse tumor model based on the cell lines are established，the whole-body optical imaging system combined with small-animal PET-CT provides a new and reliable technology for the in situ tumor model，which is a new tool to further study the mechanism of metastasis and drug discovery.

Human hepatic carcinoma;Tumor model;Luciferase;Bioluminescent imaging;Small-animal PET-CT

R541 R332

A

1671-7856(2011)03-0010-04

2010-06-21

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.003

卫生部项目，实验动物和人类疾病动物模型资源扩展(200802036)和十一五新药专项支持(2008ZX09305-001)。

李小颖(1981-)，女，实习研究员。E-mail：lixiaoyinghebei@163.com。

张连峰，E-mail：zhanglf@cnilas.org。