牛c-myc基因的克隆及其在皮肤成纤维细胞中的表达

肖佳佳，张凤凤，熊显荣，张涌

西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100

c-myc基因是细胞进化过程中高度保守的基因之一。c-myc基因最初是从鸡病毒v-myc基因的同源物中分离出来的，由3个外显子及2个内含子组成，第 1个外显子不编码，只起调节作用，只有外显子2和3与v-myc相对应。在不同动物中，c-myc基因的第 1外显子差异较大，其他则高度保守。c-myc基因编码的相关蛋白，是一个由439个氨基酸组成的蛋白质，分为C端 (C-terminal)、中间部分和N端 (N-terminal)。C端140个氨基酸是DNA结合和形成杂合体的结构域，包含碱性螺旋-环-螺旋以及亮氨酸拉链结构 (Basic helix-loop-leucine zipper，BHLH-LZ) 及与Max的结合区。N端143个氨基酸是转录激活功能域，包含2个myc家族特有的高保守序列。中间部分包含1个非特异性DNA结合区和1个核定位信号 (Nuclear localiaztino singal，NLS)，前者的功能是协助碱性区寻找DNA特异结合位点；后者是 c-myc蛋白进入核内所必需的结构，负责将c-myc蛋白转入并定位于核内[1-3]。

2006年，Yamanaka等[4]首次开创性地利用反转录病毒分别将4个转录因子 (Oct-3/4、Sox2、KLF4和 c-Myc) 一起导入小鼠胚胎成纤维细胞和成体成纤维细胞，并都成功得到小鼠iPS细胞。2007年，Takahashi等[5]又用同样的转录因子组合导入成人的成纤维细胞，得到人的iPS细胞。这些细胞与ES细胞在形态、增殖、表面抗原、基因表达和体内外分化等方面基本一致。2008年，Dubois等[6]的研究证明，造血干细胞的功能特别依赖c-Myc因子。胚胎干细胞的自我更新能力有赖于白血病抑制因子 LIF的存在。LIF结合其相识受体后，活化转录因子STAT3，后者激活 c-myc的表达。STAT3或 c-myc突变体等位基因 (T58A) 的结构性表达，即使移除LIF，也能维持ES细胞的自我更新和多能性状态；反之，抑制c-myc即使存在LIF也诱发ES细胞分化，这证明c-myc对于抑制ES细胞分化并保持其自我更新的能力具有关键性作用[7]。这些研究表明，c-myc基因在诱导成体细胞转变为 iPS细胞，并抑制其分化，使其维持自我更新和多能性状态方面起着重要作用。

本研究拟从胎牛原始生殖嵴获得 c-myc基因，构建 c-myc基因真核表达质粒，并在脂质体介导下转染胎儿成纤维细胞，并观察记录其表达情况，为进一步诱导牛的iPS提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

40日龄的秦川牛胎儿由杨凌科元克隆股份有限公司提供。载体pIRES2-AcGFP1-Nuc、牛皮肤成纤维细胞，菌株 JM109均为本实验室保存。LA Taq酶、pMD19-T Vector、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司，DNA凝胶回收试剂盒购自AXGEN公司；各种限制性内切酶购自NEB公司；小量质粒提取试剂盒购自上海生工生物技术有限公司；无内毒素质粒大量提取试剂盒购自康为公司；多种 DNA marker购自Transgen公司。

细胞培养相关试剂：基本培养基 (DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、青霉素、链霉素均购自Gibico公司；Trizol试剂购自 Invitrogen公司；FuGENE HD转染试剂(Roche) 及其他试剂购自 Sigma等公司。引物由上海生工生物技术有限公司合成；基因测序工作由华大基因 (北京) 公司完成。

1.2 方法

1.2.1 牛c-myc基因的克隆

根据已发表牛c-myc基因mRNA序列 (GenBank Accession No. BC113343)，设计合成1对引物，上游引物 Mycs：5′-TCGGCTAGC ATGCCCCTCAAC GTCAG-3′ (下划线处为NheⅠ酶切位点)，下游引物Myca：5′-GCAGAATTC GGCGCAAGAGTTCCGTAT C-3′ (下划线处为EcoRⅠ酶切位点)，由上海生工生物技术有限公司合成。

采集40日龄牛胎儿原始生殖嵴，用Trizol试剂从原始生殖细胞 (Primodial genital cells，PGC) 中提取总mRNA，经反转录得到cDNA，以Mycs和Myca为引物进行PCR反应。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃再延伸10 min。预期PCR产物长度应为1 335 bp。

1.2.2 pMD19-T载体克隆与测序

PCR产物经快速回收，回收产物 (目的片段)和pMD19-T载体在T4 DNA连接酶作用下于16 ℃连接。将连接产物转化感受态菌 JM109，菌液与IPTG和X-gal按比例混匀后涂布于含100 µg/mL氨苄青霉素的 LB平皿上筛选，挑取大小均匀的白斑摇菌，按照质粒抽提试剂盒说明书小量提取质粒，经EcoRⅠ与NheⅠ双酶切鉴定，将获得的阳性克隆质粒 (命名为 pMD19-T-c-myc，简写为 pTM) 送华大基因 (北京) 公司测序。用NCBI在线工具Blast对所克隆c-myc基因序列与GenBank中的序列进行同源性比较分析。

1.2.3 pRM的构建与鉴定

图1 pIRES2-AcGFP1-Nuc质粒结构示意图Fig. 1 Structure of the recombinant plasmid pIRES2-AcGFP1-Nuc.

将载体质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc (图1) 和测序正确的质粒pTM用内切酶NheⅠ和EcoRⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳，回收载体质粒 pIRES2-AcGFP1-Nuc和c-myc基因的DNA片段，T4 DNA连接酶连接过夜，连接产物转化大肠杆菌 JM109，经含卡那霉素 (60 µg/mL) 的LB平皿培养筛选克隆、提取质粒后，用NheⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定，再送华大基因 (北京) 公司测序。测序正确的菌株于37 ℃扩增摇菌 100 mL，提取重组表达载体阳性质粒(pIRES2-AcGFP1-Nuc-c-Myc，简写为 pRM)，测定其核酸浓度，备用。

1.2.4 重组质粒pRM导入牛皮肤成纤维细胞

转染前2 d，将牛皮肤成纤维细胞接种至6 cm培养皿，培养液为含10%新生牛血清，不含青霉素、链霉素的高糖DMEM。当细胞汇片达80%~90%时，严格按照 FuGENE HD转染试剂说明书的方法将重组质粒pRM导入牛皮肤成纤维细胞。转染12 h后换为含 10%新生牛血清，青霉素、链霉素各100 U/mL的高糖DMEM。

1.2.5 RT-PCR检测牛c-myc基因表达

转染12 h后荧光显微镜观察上述转染的牛皮肤成纤维细胞，24 h后用Trizol试剂提取总RNA，再反转录成cDNA第一链，以此为模板，用下列引物进行PCR扩增：Forward (myc)：5′-ATGCCCCTCAA CGTCAG-3′，Reverse (myc)：5′-GGCGCAAGAGTTC CGTATC-3′。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察结果。

1.2.6 Western blotting检测牛皮肤成纤维细胞c-myc蛋白表达

转染24 h后，用预冷的PBS洗涤2次，加入细胞裂解液 (150 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)，5 mmol/L EDTA，1% Triton X-100，1 mmol/L PMSF)，冰浴上裂解细胞 30 min，15 000 r/min 离心10 min，收获上清液。将上述细胞裂解后得到的上清加入 5× SDS-PAGE上样缓冲液，100 ℃煮沸10 min。13 000×g 离心10 min，取12 µL上清点样，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。以湿转印法将蛋白转到硝酸纤维素膜上，再加入用 TBST配制的5%脱脂奶粉，室温平稳摇动2 h。用TBST洗膜3次，每次10 min。加入一抗 (按1∶1 000比例用 TBST稀释，液体覆盖膜的全部)，4 ℃放置12 h以上。弃一抗，用TBST洗膜10 min重复4次。加入辣根过氧化物酶偶联的二抗 (按 1∶2 000比例用TBST稀释)，室温平稳摇动2 h。弃二抗，用TBST洗膜10 min重复4次。洗膜后用化学发光法显色5 min，保鲜膜包裹硝酸纤维素膜，固定在暗盒内，压X光胶片，曝光，显影，定影。用预染蛋白marker判定目的蛋白的相对分子质量。

2 结果

2.1 牛c-myc基因的克隆与测序

用40日龄牛胎儿PGC克隆牛c-myc基因编码序列，预期PCR产物长度应为1 335 bp。采用扩增复杂二级结构模板专用的LA Taq聚合酶进行PCR扩增，得到预期长度的扩增片段。所得扩增片段测序后，与已发表的牛 c-myc基因序列 (GenBank Accession No. BC113343) 进行同源性比较分析，核苷酸序列没有发生突变，证明所克隆片段为牛c-myc基因编码序列。

2.2 真核表达载体的构建

pTM和pIRES2-AcGFP1-Nuc 载体分别经过双酶切，胶回收，连接，转化JM109感受态细菌构建的重组质粒再经NheⅠ和EcoRⅠ双酶切和1%琼脂糖凝胶电泳，获得大小为1 329 bp的片段，与预期结果相符 (图2)。鉴定正确的质粒命名为pRM。

2.3 牛c-myc在皮肤成纤维细胞中的表达

重组质粒pRM转染12 h后，在荧光显微镜下观测 GFP的表达情况 (图 3)。结果表明质粒 pRM已转染到牛成纤维细胞内并表达。转染24 h后的细胞用Trizol试剂提取总RNA，再反转录成cDNA第一链，以此为模板用引物 Forward (myc) 和Reverse (myc) 扩增后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，获得了大小为1 317 bp的目的条带 (图4)，与预期结果相符。

图2 pRM质粒的酶切鉴定Fig. 2 Identification of pRM by enzyme digestion. M: trans15K DNA marker; 1: intact pRM; 2: pRM digested with Nhe I and EcoR I.

图3 重组质粒转染成纤维细胞Fig. 3 The fibroblasts transfected with pRM. (A) The cells transfected with pRM under microscope (100×). (B) The cells transfected with pRM under fluorescent microscope (100×).

图4 转染细胞中c-myc基因的表达检测Fig. 4 Expression detection of c-myc gene in pRM-transfected fibroblast cells. M: DL2000 DNA marker; 1: pRM-transfected fibroblast cells.

2.4 c-myc蛋白在成纤维细胞中的表达

将转染细胞和未转染的细胞用胰酶消化，预冷的PBS洗涤2次，加入细胞裂解液，冰浴上裂解细胞30 min，经离心收获上清，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜，抗体孵育，曝光，显影，定影。结果如图 5所示：转染的成纤维细胞样品出现了约49 kDa的特异性条带，阴性对照组则未出现此反应条带，与预期结果相符。

图5 c-myc蛋白的Western blotting检测Fig. 5 Western blotting detection of c-Myc protein. M: prestained protein marker; 1: pRM-transfected fibroblast cells; 2: non-transfected fibroblast cells.

3 讨论

由于牛 c-myc基因编码序列 G、C含量达到59%，所以本研究采用了能够很好地扩增复杂二级结构模板的LA Taq聚合酶，并以胎牛原始生殖嵴为材料提取总RNA，再以反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增，将得到的产物与已发表的牛c-myc基因序列 (GenBank Accesion No. BC113343) 进行同源性分析，结果显示得到的产物并未发生位点突变。本研究利用牛 c-myc基因的编码序列成功构建了重组真核表达载体pRM。该载体在转染牛皮肤成纤维细胞之后能正确表达c-Myc蛋白。

c-myc对细胞具有双重作用，既可刺激细胞增殖，也可促进细胞凋亡[8]。在细胞增殖的过程中，c-myc可使细胞由G0期进入G1期，从而由静止期向DNA的合成转变。c-myc也能促进细胞凋亡，其细胞凋亡作用依赖于 c-myc蛋白的表达水平[9]。本研究在操作过程中发现重组质粒 pRM 转染牛皮肤成纤维细胞48 h之后部分阳性细胞呈现凋亡趋势，可能是因为在其他因子不足的情况下c-myc的异常表达导致了皮肤成纤维细胞的衰老和凋亡。外源性c-myc转录因子与其他因子组合，可以将哺乳动物体细胞诱导为 iPS细胞，但到目前为止，将体细胞核重编程为iPS细胞的分子机理以及c-myc转录因子在此过程中起何具体作用仍不是很清楚。2007年，Yamanaka[10]提出了一个关于iPS细胞诱导过程中外源转录因子如何起作用的模型，他认为Oct4促使细胞向ES细胞方向发展，在Sox2的共同作用下，调控细胞一系列基因的表达，使细胞获得多能性状态，c-myc起到打开染色体结构，促进细胞增殖的作用，但同时c-myc还导致细胞的衰老和凋亡，而Klf4则阻断了细胞衰老和凋亡的过程。近年来，在 iPS细胞的研究过程中，人们曾尝试除了经典的四因子组合之外，用减少某些因子的方法，看能否诱导得到iPS细胞。Huangfu等[11]仅用Oct4、Sox2两个因子和一种组蛋白乙酰基转移酶抑制物——丙戊酸(Valproic acid，VPA) 成功得到iPS细胞。Kim等[12]用Oct4分别与Klf4或c-Myc组合，以二因子成功诱导小鼠神经干细胞转变为iPS细胞。Kim等[13]又尝试仅以 Oct4的外源性表达来诱导小鼠神经干细胞，成功得到 iPS细胞，值得注意的是：小鼠神经干细胞本身就高水平表达Klf4和c-Myc因子。虽然这些研究都成功得到 iPS细胞，但重编程的效率却随着转录因子数目的减少而降低。

总之，本研究成功地从胎牛原始生殖嵴中克隆出牛 c-myc基因编码序列，其核苷酸序列和对应的氨基酸序列与发表的牛 c-myc基因序列完全一致，为进一步研究 c-myc基因功能以及下一步特定因子诱导牛体细胞转变为牛iPS细胞的研究奠定了基础。

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