Ouabain对髓袢升支粗段管周膜50pS钾通道活性的影响

张成标，潘志强，刘勇林

(徐州医学院1.江苏省麻醉学重点实验室、2.生理学教研室，江苏徐州 221002)

肾脏髓袢升支粗段(thick ascending limb，TAL)对NaCl的主动重吸收启动了髓质渗透梯度的形成，其动力来自管周膜上的钠－钾泵。50pS钾通道是管周膜上分布最多的钾通道［1－2］，在NaCl的主动转运中发挥重要作用。50pS钾通道的活性是否受钠－钾泵活动的影响，目前尚不清楚。本实验利用单通道膜片钳技术，观察钠－钾泵抑制剂ouabain对髓袢升支粗段管周膜50pS钾通道活动的影响，探讨50pS钾通道是否在功能上与钠－钾泵偶联。

1 材料与方法

1.1 肾小管的分离 SD大鼠，体质量70～120 g，♀♂不拘。由徐州医学院实验动物中心提供。大鼠经10%的水合氯醛(400 mg·kg－1)腹腔麻醉后，立即打开腹腔取出肾脏，去除包膜，从肾脏的中间部分用刀片切出厚约0.5～1 mm的冠状切片，浸入浓度为1 g·L－1胶原酶溶液，放进37℃恒温水浴箱中消化45～55 min。在解剖显微镜下分离出肾小管髓袢升支粗段，放在涂有多聚赖氨酸的载玻片(5 mm×5 mm)上固定，并移送至已加入浴液的膜片钳系统的细胞记录槽中。

1.2 膜片钳单通道记录 用P-97型微电极拉制仪(Sutter，美国)四步拉制玻微电极，微电极尖端的直径约为0.5～1.0 μm，拉制完成后再适度抛光。在内充电极内液时，电极的入液电阻为10～30 MΩ。

选取清洁、光滑、完整的肾小管进行膜片钳实验。本实验主要采用细胞贴附式(cell-attached)单通道电流记录方法。对经胶原酶消化过的髓袢升支粗段肾小管的管周膜进行封接，形成高阻封接后即形成细胞贴附式记录模式。实验使用的膜片钳系统为Multiclamp 700B膜片钳放大器(Axon公司，美国)和Digidata 1440A模－数转换器(Axon公司，美国)，记录和分析软件为pCLAMP 9.2(Axon公司，美国)。采样频率为10 kHz，滤波频率为0.2 kHz。用通道总开放概率NPo作为衡量通道活性大小的指标，它是单个通道开放概率(open probability，Po)与通道开放数(N)的乘积，其数值可用公式NPo=Σ(1×t1+2×t2+…+i×ti)计算。公式中的i表示通道开放的电流水平，在该水平有i个通道同时开放;ti表示通道在该水平开放的持续时间占总时间的分数。

1.3 实验溶液及药品 电极内液(mmol·L－1):KCl 140，MgCl21.8、HEPES 10(pH=7.4)。浴液(mmol·L－1):NaCl 140、KCl 5、CaCl21.8、MgCl21.8、HEPES 10(pH=7.4)。胶原酶(collagenase type IA，购于Sigma公司)溶液在每次实验时临时配制，每次称取1～2 mg，用浴液稀释成浓度为1 g· L－1的酶溶液。Ouabain(购于Sigma公司)先用浴液配制成一定浓度的母液，实验时用微量加样器抽取一定量的母液加入细胞记录槽，使浴液的药物浓度达到实验要求。

2 结果

2.1 记录通道类型及电导大小的确定［5］实验中记录到的单通道电流能被钾通道阻断剂Ba2+阻断，证明其是钾通道电流。单通道电流大小随着钳制电压的变化而变化，以电压为横坐标、电流为纵坐标作出电流－电压(I-U)曲线，根据曲线斜率计算出通道电导约为50pS。

2.2 Ouabain对髓袢升支粗段管周膜50pS钾通道活性的影响 在细胞贴附式记录模式下，先记录3～5 min，然后向浴槽内加入一定量的ouabain母液，使浴液中的ouabain浓度达到20 μmol·L－1，结果通道开放概率(NPo)从加药前的0.43±0.28降低到0.01±0.02(n=7，P＜0.01)，将ouabain洗脱后NPo恢复到0.40±0.32(n=7，P＜0.01)，表明20 μmol·L－1的ouabain对50 pS钾通道具有可逆性抑制效应。

剂量－效应关系研究显示，ouabain对50 pS钾通道的抑制作用与其浓度正相关(Tab 1)。

Tab 1 Effects of different ouabain concentration on NPo of the basolateral 50pS K+channels incell-attached patchs(±s，n=7)

Tab 1 Effects of different ouabain concentration on NPo of the basolateral 50pS K+channels incell-attached patchs(±s，n=7)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs pre-addition of ouabain group

Post-addition of ouabain 0 μmol·L－1 Ouabain concentration Pre-addition of ouabain 0.38±0.13 0.36±0.13 5 μmol·L－1 0.36±0.18 0.17±0.09* 10 μmol·L－1 0.32±0.19 0.06±0.03＊＊20 μmol·L－1 0.43±0.28 0.01±0.02＊＊

3 讨论

肾脏髓袢升支粗段具有重要功能，因为它不仅重吸收20%～25%的Na+、Cl－和K+，更重要的是，髓袢升支粗段对Na+和Cl－的主动重吸收是髓质渗透梯度建立的直接动力，在尿液的浓缩和稀释方面发挥重要作用。髓袢升支粗段对NaCl主动转运的原动力来自管周膜上的钠－钾泵，而管周膜钾通道活动也影响了髓袢升支粗段对NaCl的主动转运过程。但管周膜钾通道和钠－钾泵之间的相互关系及其作用机制尚未阐明。

Ouabain是特异的钠－钾泵抑制剂，较高浓度(微摩尔级)的ouabain对钠－钾泵有较强的抑制作用，从而影响细胞内Na+和细胞外K+逆浓度梯度的跨膜转运。Ouabain还通过作用于钠－钾泵介导与细胞增殖和细胞凋亡有关的信号传递［3］。此外，ouabain可作用于钠－钾泵影响细胞间连接的形成［4］。本研究显示，ouabain对管周膜50pS钾通道有抑制作用。这种作用不太可能是ouabain从膜外侧对钾通道的直接作用，因为我们采用的是细胞贴附式(cell-attached)单通道记录模式，药物难以进入形成高阻封接处细胞膜片的外表面;ouabain也很难进入细胞内从膜内侧直接作用于钾通道，因为ouabain是水溶性物质，不能穿越脂溶性的细胞膜。因此，ouabain对管周膜50pS钾通道的抑制作用可能由其他间接途径引起。我们最近的研究表明［5］，髓袢升支粗段管周膜50pS钾通道的活动受细胞内ATP的调控。由于细胞内ATP浓度与钠－钾泵活动情况密切相关，因此，我们推测，ouabain对50pS钾通道的抑制作用可能继发于钠－钾泵抑制引起的细胞内ATP浓度的降低。

本研究进一步提示，在髓袢升支粗段细胞内ATP浓度的变化介导了管周膜钾通道和钠－钾泵在功能上的偶联关系。

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