马铃薯脱毒试管苗扩繁常见的污染及防治措施

穆艳娥，王拴福，姬青云，柴生武，邓利爱，张东红，石维山

（山西省薯类脱毒研究中心，山西 太原 030006）

利用组织培养技术进行马铃薯脱毒试管苗快繁时，常常会出现不同程度的污染，在高温高湿的情况下污染更为严重，导致组织培养工作的失败，造成严重的经济损失。因此，在组织培养过程中，控制污染是非常重要的技术环节。本文主要从污染的主要病原及症状、常见的污染及产生原因方面进行了阐述，并提出了相应的防治措施。

1 主要病原及症状

污染产生的病原主要有细菌和真菌两类。细菌污染的症状出现较快，一般在接种1～2天即可出现，表现症状为在培养基或材料表面常出现黄色、粉液状半透明膜状。真菌污染的症状出现比细菌慢，一般在接种5～10天才有所表现，表现症状为初期如针状的雾斑，以后长出菌丝，继而很快出现黑、白、黄、绿等色的孢子。

2 常见污染及产生的原因

2.1 细菌污染

主要是由于材料本身或培养基灭菌不彻底造成的。接种前如果培养瓶清洗的不干净而灭菌又不彻底，耐高温的杂菌不能被杀死，接种前培养基就会被细菌污染；接种时如果工作人员操作不规范，使用未消毒或消毒不彻底的器械或者是用手接触器皿边缘或材料，也可导致接种后外植体周围出现细菌污染。

2.2 真菌污染

接种前培养基就出现了真菌污染，其原因多数是由于封口不严或培养基存放的环境中孢子浓度过大造成的；其次，如果母液储备液被污染，也能引起培养基表面大量真菌污染。接种后初期，培养基表面出现了真菌污染且位置不定，其原因可能是由于超净工作台的滤布不洁净或接种室孢子浓度过大造成的。如果接种后较长时间出现了真菌污染，主要原因是培养材料携带了内生菌或封口不严造成的。接种后外植体周围出现真菌污染，主要原因是由于苗源瓶中的苗源已被杂菌感染，但由于感染初期菌源太小，工作人员肉眼不易发现，接种到培养基瓶上从而引起感染；另外，如果苗源瓶表面消毒不彻底，也可将菌带入接种瓶内而引起感染。

3 防治措施

利用组织培养技术进行马铃薯脱毒试管苗快繁是一项无菌操作技术，不仅要求工作人员在操作过程中遵守无菌操作规程，而且培养室、工作人员的衣物以及操作过程中所用的一切用具、培养基、材料等都要求无菌，稍有疏忽就会导致组织培养工作的失败，造成严重的经济损失。

3.1 接种前消灭污染菌源

3.1.1 消灭容器杂菌，保证容器清洁。洗净的玻璃容器应发亮，内外壁水膜均匀，瓶壁不挂水珠。瓶盖也要认真涮洗，清洗干净后晾干与瓶子一起存放备用。取拿容器时尽量不接触内壁。

3.1.2 消灭水质杂菌。培养基母液最好用蒸馏水配置，也可用纯净、无色透明、无悬浮物的食用水制作，以减少菌源和避免杂菌滋生蔓延。配置好的母液要置于4℃冰箱中保存。

3.1.3 培养基灭菌。培养基装入高压灭菌锅内灭菌时,升温初期打开放汽阀将冷空气充分放尽，待锅内温度升至105℃时关闭放汽阀。空气排不尽易造成高压低温现象，达不到灭菌的目的。升温至120～121℃稳定灭菌20～25 min，但不宜超过30 min，否则易引起培养基凝固不良。为了增强灭菌效果,可以在培养基中加适宜的抗生素。

3.1.4 选择无污染培养基。把高温高压灭菌的培养基置于无菌室内保存，在室温下放置2～3天，检查培养基，剔除灭菌不彻底的培养基，选用干净无菌的培养基。

3.1.5 接种室消毒。接种前，首先对超净工作台进行彻底消毒。用75%的酒精棉擦拭超净工作台，然后打开紫外灯，照射20 min后关闭紫外灯，开启风机，用无菌风吹10 min后方可开始工作。定期用紫外线灯光对接种室照射消毒 20 min，以达到杀灭接种室内菌源的目的。

3.1.6 工作人员消毒。工作人员使用的工作服、帽子、口罩等要保持干净，并定期进行消毒。经常检查消毒锅的灭菌质量，若发现问题要立即检修。

3.2 接种时严格无菌操作

3.2.1 仔细观察待转基础苗，确认无污染才能取用。用酒精棉(或酒精布)擦拭待转瓶苗的外壁，消除附着在瓶外壁上的杂菌后转入无菌室。

3.2.2 工作人员消毒。工作人员进入无菌室时要洗手、换衣，并戴帽子和口罩，进入后首先要用75%的酒精仔细擦手，然后将工作台面及台壁用75%的酒精棉(或酒精布)擦拭消毒。

3.2.3 接种工具消毒。所用的接种工具如镊子、剪刀、支架都要从外到内、从正到反在酒精灯的外焰上来回消毒冷却后待用。接种时瓶口靠近酒精灯火焰，每接一瓶所用工具消毒一次。

3.2.4 接种后的培养基瓶口必须封严,以减少瓶内与室内空气的对流，控制气流传菌。

3.2.5 超净工作台上尽量少放瓶子，接种瓶、苗源瓶

(基础苗)不能堆放过满，以保证气流畅通。

3.3 内生细菌的防治

内生细菌在外植体的初级培养中不易被发现，随着继代次数的增加，菌量慢慢累积发展才在培养基上显现出来。一般可通过在培养基中添加抗生素或抑菌剂来防止和减少细菌等内生菌的污染。在使用抗生素时需要注意以下几点:（1）对症下药；（2）确定最适抑制浓度；（3）确定抗生素在培养基上的作用和稳定性；（4）确定抗生素不会对植物造成伤害或突变。例如，可在培养基加入1 mL/L的庆大霉素。

3.4 接种后严格管理

3.4.1 严禁非工作人员出入，工作人员入内时必须穿戴清洁工作服并套鞋套(或专用拖鞋)，以控制外界杂菌传入无菌区。

3.4.2 培养室内光照控制在2000～3000 Lx，每天20～25℃光照16 h。每隔一周用甲醛熏蒸消毒一次，具体做法是将50 mL甲醛倒入15 g左右高锰酸钾中,密闭接种室门窗24 h，可杀死空气中的污染菌源。

3.4.3 及时挑出培养室被污染的瓶苗，然后将污染苗用高压锅灭菌后。集中远距离深埋，彻底消灭再侵染源。当特别珍贵、稀少的资源被污染时,如果污染程度较轻，可以对其进行挽救，方法是：先将瓶苗移出培养室,然后用酒精棉将污染处盖住,用无菌操作剪将未污染的部分剪下来，先用75%的酒精冲洗30 s,再用无菌水冲洗2次,容器表面消毒后移入超净工作台,再用0.1%的Hg2CL2浸泡4～10 min,最后用无菌水冲洗3～5次后转接到新培养基上。处理后的材料要与其他脱毒苗分开放置,观察一段时间确定无污染再放回原处保存。