动物检疫实验室测量审核样品制备及样品库研究和实践

张利峰，刘来福，王 姝

（北京出入境检验检疫局，北京 100026）

引言

测量审核（Measurement Audits）是实验室对被测物品（材料或制品）进行实际测试，将测试结果与测量审核机构提供的参考值进行比较的活动。通俗的讲，测量审核是能力验证计划的有效补充，是一对一的能力验证计划，是经过权威认可机构认可的运行科学规范的实验室间比对，测量审核数据是中国合格评定国家认可委员会（CNAS）判断实验室能力的重要技术依据。国际标准ISO/IEC:17043是指导各国开展测量审核和能力验证活动的权威标准，CNAS的能力验证处、实验室处、检查机构处等部门可以通过利用测量审核和能力验证这种外部质量保证（EQA）工具，识别与国际同行机构之间的管理差异，补充其内部质量控制技术，为自身的持续改进和质量管理提供信息。实验室的用户、监督和管理机构、评价机构等可通过利用CNAS测量审核结果，判断实验室和检查机构等是否具有从事校准／检测活动的能力，以及监控他们能力的持续状况。

相对于能力验证计划的组织受到项目方案设计、样品制备、参加实验室数量以及费用投入等多种因素的制约，每年实施的项目十分有限。而测量审核活动可以采用能力验证计划项目、有证参考物质等多种类型的已获得指定值的试验样品，故更具广泛性、常态性和实时性。目前，测量审核活动在我国还处于刚起步阶段，经过前几年CNAS在实验室测量审核参考比对机构认定工作研究探索的基础上，2010年2月发布了CNAS认可委（秘）（2010）16号文件《关于测量审核指定机构相关事宜的通知》，发布了《测量审核指定机构管理办法》以期完善测量审核活动的管理。在该办法中测量审核首次明确定义为“合格评定机构对被测物品（材料或制品）进行校准/检测，将校准/检测结果与参考值进行比较的活动。”使之与能力验证活动相得益彰，互补完善，成为了评价实验室检测和校准技术能力的又一重要手段。

在动物检疫领域的测量审核活动方面，我国正处于刚起步阶段。我国在动物检疫测量审核用样品的研究制备及样品库的建设与管理方面还属于空白。最突出的问题就是我们还没有系统研究和建立起一个与动检领域测量审核需求相适应的种类齐全、科学可靠、管理和可量值溯源的测量审核用样品库。

随着世界上动检领域高新测量技术的飞速发展，需要品种越来越多、品质越来越高的测量审核用样品。开展动物检疫实验室检测能力的确认将主要依赖于是否拥有具有生物学特性量值的约定标度的复现与溯源的测量审核用样品。可以说，测量审核用样品的研制已经进入了一个最具活力、最富创新性和最有生命力的发展阶段，测量审核用样品在国民经济建设中显示出巨大的经济效益、社会效益和科学价值。

1 动检领域测量审核样品的基本特点

在测量审核用样品的研制方面，动物检疫领域有很多独特的方面，具体分析大致有以下几种基本特点。

1.1 动检领域尚处于定性检测阶段

测量是依据一定的法则，将某种物体或现象所具有的属性或特征用数字或符合表示的过程。它不仅可以对事物的属性做定量的说明（即确定特定属性的水平），也可以对事物的属性做定性的说明（即确定特定属性的类别）。动物检疫领域目前尚处于定性检测的阶段，诸如ELISA试验、琼脂扩散试验、血凝抑制试验、PCR和实时荧光PCR试验、中和试验、病毒分离试验等等，这些动检领域经常使用的检验方法，或者是以图形形式，或者是以相对的数据形式来反映检验结果，但是最终由于尚无严格意义上的不确定度等数据作为支撑，均属于定性结果的范畴，也就是统计学上常说的属于定名试验而不是定序试验。因此，目前的一些针对定序试验所设计的一些统计学方法如Z比分数、En值等尚不适用于动检领域，而动检领域常用的Cv变异系数的统计方法是否适用于动检领域的测量审核或能力验证结果的评价尚无定论。

1.2 生物安全

如涉及的检疫对象有的是一类病原微生物，有的是二类病原微生物，在其处理、检疫和运输过程中要注意很多生物安全的方面。

1.3 生物活性和稳定性

样品都是具有生物活性的病原微生物或者是抗体或者是核酸序列等等，相对应的就是样品的稳定性检验需要特别重视。

1.4 病原微生物的变异性导致的测量审核样品的时效性

动物病原微生物核酸序列、蛋白构象、毒力等等的不断变异，以及因此导致的相应抗体也随之而变化的情况，要求动检领域测量审核样品的研制工作需要及时跟踪和分析研究最新的疫病分子生物学和流行病学变化情况，及时调整和重新研制相应的测量审核样品。

1.5 生物样品成份的复杂性、相互干扰性和非种属特异性

现代的疫病诊断技术如 PCR、荧光PCR、ELISA、血凝抑制、中和试验、病毒分离实验等等检测和诊断技术，往往都有其技术方法的局限性，只能从某一个角度证明被检物品的某一特性值的存在，最终的确诊需要综合多种检测方法所获得的数据才能下定结论。这其中的原因就是生物样品成份的复杂性、相互干扰性和非种属特异性等方面。

关于分子生物学标准物质/标准样品的研制工作，在《标准物质和标准样品生产者认可准则CNAS-CL04:2007）》中提到，该领域曾经只是一个专门研究领域，但目前逐渐达成共识:商业开发的测量程序和过程都必须验证，无论它们是为疾病的防治和测定提供帮助，还是为实施法律及法医科学提供服务，还是对制造遗传工程食品和药品进行控制的。很显然，这是需要很多新的标准物质/标准样品，但是，最近人们才充分意识到这项工作的复杂性。

2 动检领域测量审核用样品制备关键点探索

新的ISO/IEC 17043:2010《合格评定-利用实验室间比对的能力验证》已经正式发布，该标准为实施实验室能力验证的组织的能力规定了国际协调一致的要求，明确了测量审核的作用和意义。在动检领域开展测量审核尚属于起步阶段，有关动检测量审核的样品制备、结果评价等方面都有待探索。

2.1 样品适用那些检测标准方法的研究

在进行评价参加测量审核的实验室的能力确认时，要尽量选择能体现具体项目检测能力的方法，而且要采用尽量多的方法。在制备测量审核样品时，要掌握该种疫病的主要检测标准和方法的适用范围，分析不同检测标准和方法之间的区别和差异。明确所研制的测量审核样品适用于那些标准，不适用于那些标准。要对检测对象的目标基因片段、目标蛋白、不同亚型的菌毒种的区别差异之处，如毒力差异、基因突变的差异、蛋白构相的差异等等了如指掌。

2.2 检测试剂的差异性及其结果判定之间的异同

应了解和掌握目前市场上常用的该种疫病检测试剂的异同。也包括所用细胞、鸡胚、实验动物等等影响因素。即使是同一种检测方法，但是由于所使用的检测试剂盒生产厂家不一样，在结果判定之时也有异同，应注意到这些差异，了解所制备样品与该种检测试剂之间的吻合度。

2.3 检测设备之间的差异性

由于同类型检测设备所使用的硬件、分析软件和耗材不一样，如不同生产厂家的荧光PCR仪，在对同一样品进行分析时也会有一些差异，因此，应了解和掌握所制备样品在同类型设备上的表现。

2.4 拟制备测量审核样品的溯源性及溯源链

测量审核样品是合格评定机构对被测物品进行检测，将检测结果与参考值进行比较的活动。因此，该被测物品的溯源性非常重要。但是，正如曹实等在关于医学校准实验室溯源性问题中所提到的目前常规的医学临床检验项目大约有400～700个能溯源至SI单位的仅有50个左右，大多数项目因其检测生物源性样品的复杂性 ，被测量定义的复杂性等原因其量值溯源停留在较低的计量学水平。在动检领域这方面的溯源性问题基础就更加薄弱。

2.5 测量审核样品的制备

2.5.1 原料选择原则

原料应具有高度稳定性和适合检测或试验要求的特异性，不应含有干扰使用目的的杂质；尽可能使样品在性质上与供试品相对一致；必须具有足够数量的原料，以满足多年使用的需要。

2.5.2 样品特性值的标定

初步标定:选好原料后，根据各种样品的不同要求，用适宜的保护缓冲液稀释，然后用国际参考试剂进行初步标化，大体确定其效价单位数。

样品的分装，冻干和熔封:将上述初步标定的样品精确分装。需要干燥保存者分装后立即进行冻干和熔封。整个分装、冻干和熔封过程，必须密切注意各安瓿间效价和稳定性的一致性。

正式标定:样品应进行效价测定，特异活性稳定性试验，无菌试验。冻干样品还应进行水分测定和真空度检查。

效价协作标定:以国际同类标准品为依据，组织有关单位参加，对样品的效价进行协作标定，标定结果必须经统计学处理，以确定样品的特性值。

2.5.3 样品的检验分析、评价等需要研究分析的其它相关因素

样品特性值不确定度的探索、样品的均匀性检验、样品的稳定性检验、样品保存条件和保质期的研究、样品运输包装条件研究、参比实验室结果的评价原则研究、相应样品的生产规程和质量控制规范的编制。

3 动检领域测量审核用样品库建设的研究与实践

实验室评审的现场考核具有时间短等局限性，而专家携带样品前往考核具有争议性、权威性和不方便等问题。测量审核则解决了这个问题。而且测量审核样品要比标准物质更便宜。

以北京检验检疫局动检实验室为例，实验室在相关科研项目的支撑下，按照上述测量审核样品研制要求，制备了相应的测量审核样品，建立了一个管理科学规范、样品能够适用于测量审核目的、不会在运输途中发生性质改变、可以随时向需要提供测量审核试验的实验室提供样品及能够和国外的能力验证提供者或者参考实验室进行检测结果比对的一个动物检疫实验室测量审核用样品库，包括有禽流感、新城疫、猪链球菌、口蹄疫、鲤春病、传染性造血器官坏死病和白斑病等测量审核样品。在具体建设过程中，主要进行了以下几方面的工作。

3.1 测量审核样品库硬件体系建设实践探索

3.1.1 样品冷冻保存硬件建设

动检领域生物样品一般都需要冷冻或冷藏保存，在冷链条件下运输。在研究了动检领域不同测量审核样品的最佳储存条件之后，我们专门购置了2台-80℃超低温冰箱，用于长期冻存核酸样品和血清样品。配置了双路供电系统，确保了供电保障问题。配备了空调系统，确保环境温度的适宜。

3.1.2 样品库安全措施硬件建设

为保障测量审核样品及其病原微生物菌毒种的生物安全和防盗、防火等安全问题。专门为样品库设置了一间房屋，实行了双人双锁，建设了红外线防盗、电子遥控卷帘门、门禁卡开启等安防措施。

3.1.3 冰柜温度监控系统建设

为了24小时监控冰柜的温度波动，实时掌握和及时采取相应措施，保障样品库冰柜的温度在一个适宜的温度范围内，确保样品的保存效果。我们为样品库安装了海慧实时环境温湿度无线监测系统。每半个小时样品库的温度探测仪发生一次实时的温度情况，通过无线网络，在一台监控电脑上记录和储存样品库的温度变化情况，如果发生温度异常，系统会实时自动发生短信到绑定的监控人的手机上，提示样品库监控人员有异常情况。

3.2 测量审核样品库软件体系建设实践探索

3.2.1 样品标识和软件管理系统

将制备好的测量审核样品储存在专门的冷冻盒里，每管样品上面都有清晰的样品标签信息，每种样品的冻存盒上都有唯一的条形码。通过样品管理软件，将其扫描后输入样品制备的信息、特性值、数量、储存位置、存取调用记录和时间、样品有效性状态等信息。

3.2.2 测量审核样品库管理体系文件的建设

编制样品库的管理体系文件，负责样品的日常维护，以确保其保持技术性能和适宜开展对应指定能力的测量审核。

制定样品库的使用、维护、更新和管理办法；建立样品一览表，样品档案和制备样品的技术说明书；便于检索和调用；记录样品特性值漂移情况，明确各种样品定期监测的周期（根据目前数年来积累的数据分析，血清样品和添加了核酸保护剂的核酸样品在-80℃冰箱的保存条件下，至少1年内样品有很好的稳定性）；建立测量审核活动的记录表格，如测量审核证书、测量审核结果报告、测量审核样品发送表、测量审核样品档案、测量审核样品收样确认表等；样品包装和运输技术要求。

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[2]宋翠平，齐铁英.兽医生物安全实验室生物安全管理体系的建立与运行[J].中国动物检疫，2010,27（9）:19-20.

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