PCR技术的发展及其在烟草中的应用

李 林，陈 武，周清明，黎定军

(1 湖南农业大学农学院，长沙 410128；2 湖南农业大学生物安全科技学院，长沙 410128；3 湖南广播电视大学，长沙 410004)

PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应， 是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。现已被广泛应用于农学、植物病理学等领域的研究。最初的PCR技术相当不成熟，但在随后的几十年里，PCR技术被不断改进，它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个 kb的基因到目前已能扩增长达几十个 kb的DNA片段[1]。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，本文对其近年来的主要扩展及应用进行综述。

1 PCR技术的扩展

1.1 AP-PCR技术

1.1.1 AP-PCR技术的定义、来源及特点

AP-PCR(Arbitrarily primed PCR)技术[2]，是指在对所扩增基因顺序一无所知的情况下，主观上随意地设计或选择一个非特异引物进行PCR扩增，反应在不严格条件下扩增1至数轮后，再于严格条件下进行。通过比较扩增产物的指纹图，即可反映出待分析基因组的特征。AP-PCR 技术由 Williams等[3]于20世纪90年代建立，它可以快速地从两个或更多的个体组织细胞中分离出差异基因或基因差异表达产物，具有简单、灵敏、有效和重复性好等特点。

1.1.2 AP-PCR技术的应用

AP-PCR技术是常规PCR技术在差异基因分离方面的扩展，主要应用在：(1)差异基因的分离，Liang和Pardee[2]应用AP-PCR技术对正常A31和肿瘤起源的BPA31细胞进行了鉴定，并分离得到了仅存在于正常细胞的N1及仅存在于肿瘤细胞的T1片段；(2)菌株鉴定，杨国玲等[3]采用AP-PCR技术对甲真菌病病原菌进行了快速鉴定；(3)遗传作图，Welsh等[2]成功地应用AP-PCR方法快速鉴定了重组鼠(C56BL/6J×DBA/2J)扩增多态性在染色体图谱中位置。

1.2 LP-PCR和彩色PCR

1.2.1 LP-PCR和彩色PCR的定义

LP-PCR(Labelled primers PCR)，即标记PCR，它是指利用同位素、荧光素等对PCR引物5’端进行标记，通过PCR反应扩增，来检测目的基因存在与否。

彩色PCR (Color Complement Assay)是指利用荧光染料标记引物的 5’端，不同荧光(荧光染料TAMRA呈红色荧光，JOE和 FAM呈绿色荧光，COUM 呈蓝色荧光)标记的引物同时参加反应，经PCR反应扩增后，根据不同荧光的色泽来判断目标基因是否存在及扩增基因的类型[4]。

1.2.2 LP-PCR和彩色PCR的比较

LP-PCR与彩色PCR由荧光PCR[5]发展而来，彩色PCR是LP-PCR的一种。与常规PCR相比，LP-PCR更为直观，其省去了限制性内切酶酶解及分子杂交等繁琐步骤，并且一次可以同时分析多种基因成分，但是LP-PCR只能对产物进行定性鉴定。与LP-PCR相比，彩色PCR通常需要2种不同颜色的引物：一种作为基因检测引物；另一种作为控制条件的内对照，但是在检测多点突变时，彩色PCR需用更多的色彩[4]。

1.2.3 LP-PCR和彩色PCR的应用

LP-PCR和彩色PCR是常规PCR技术与标记技术相结合的产物，LP-PCR常被用于大量临床标本的基因诊断，同时可用于对 PCR产物进行定性鉴定。彩色PCR常被用于检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的型别鉴定等，如被用于检测多突变点的遗传病[4]。

1.3 免疫PCR技术

1.3.1 免疫PCR技术的定义、来源及特点

免疫PCR(immuno polymerase chain reaction, IMPCR)是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术，它综合了固相免疫反应和PCR的特点。免疫PCR技术是1992年Sano建立的一种检测微量抗原的高灵敏度技术[6]。与常规PCR及普通ELISA相比，免疫PCR优势明显，具体表现为：灵敏度增加，可以同时进行多种抗原/半抗原检测，有更宽的线性范围[7]。

1.3.2 免疫PCR技术的应用

免疫PCR技术是常规PCR技术在医学免疫学领域的主要扩展，它常被用于：(1)激素和细胞因子的检测，Furuya等[8]运用免疫PCR技术对白介素-18进行了检测，灵敏度提高了10000倍；(2)生化酶类的检测，Chang等[9]通过改良的免疫PCR方法对大肠杆菌β-葡萄糖苷酶进行了检测；(3)致病微生物的检测，Monteiro等[10]将磁珠技术和免疫PCR技术相结合，设计了一种能检测粪便中幽门螺杆菌的新方法；(4)寄生虫感染的检测，国内利用免疫PCR技术检测弓形虫C抗原，敏感性较ELISA法提高了200倍[2]；(5)其他毒素或蛋白的检测，宋云扬等[11]建立的检测金葡菌肠毒素B的双抗体夹心免疫PCR方法比ELISA灵敏度高1000倍。

1.4 原位PCR技术与原位反转录PCR技术

1.4.1 原位PCR技术与原位反转录PCR技术的定义

原位PCR(in situ polymerase chain reaction)技术将PCR高效扩增与原位杂交的细胞定位相结合，在组织细胞水平，原位检测单拷贝的特定 DNA或 RNA序列[12]。原位反转录 PCR技术(in situ reverse transcription PCR,RT in situ PCR or in situ cDNA PCR)，简称原位 RT-PCR，它是指先将细胞和组织进行处理(固定、酶消化)，以获得适度的细胞通透性；再通过逆转录使rnRNA转录成cDNA；然后把载玻片放人热循环机，对靶DNA等细胞内靶目标在原位进行 PCR扩增(扩增反应中含有标记的单核苷酸)；最后通过检测标记产物的方法检测扩增产物[13]。

1.4.2 原位PCR技术与原位反转录PCR技术的比较

原位 PCR技术在进一步提高以单细胞底物进行PGD (preim plantation genetic diagnosis,PGD)的效率的前提下，由 Thornhill［14］提出，它具有细胞定位能力和高度特异敏感。原位反转录PCR技术是原位PCR技术的一种，它检测的靶序列为RNA，由Nuovo等[15]1992年发明，具有操作简单、流程短、省时等优点；同时具有特异性差、容易出现非特异性 DNA产物、造成假阳性、且扩增效率较低，特别是石蜡切片[16]等缺点。

1.4.3 原位PCR技术与原位反转录PCR技术的应用

原位PCR技术是常规PCR在细胞学领域的扩展，它常被用于感染性外源基因的检测、内源基因的检测与导入基因的检测等，如对H IV、结核杆菌等进行的检测[17]。原位反转录PCR技术常被用于扩增和检测标本中罕见的rnRNA，如定量细胞表达特殊rnRNA的丰度、检测扩增产物的细胞起源及检测细胞群中基因表达的趋势等[18]。

1.5 定量PCR技术

1.5.1 定量PCR技术的定义及特点

定量PCR(Polymerase Chain Reaction)技术有广义和狭义两层含义。广义的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义的定量 PCR技术，又称为实时荧光定量 PCR技术(rea1-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)，它是严格意义上的定量 PCR技术，指用外标法(荧光杂交探针保证特异性)通过监测PCR过程(监测扩增效率)达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)，1996年由美国Applied Biosystems公司推出。与常规PCR技术相比，定量PCR技术不仅实现了对DNA模板的定量，同时具有灵敏度更高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点[19]。

1.5.2 定量PCR技术的应用

定量PCR技术实现了PCR技术从定性分析到定量测定的发展，它常被应用于临床微生物、食品微生物、临床肿瘤学的检测、肿瘤耐药基因表达的研究、细胞因子的表达分析等方面。其中，临床微生物和食品微生物是定量 PCR应用中最重要的两个方面，彭年才等[19]2010年自主研发了用于食品安全检测的实时定量PCR仪，并已投入产业化应用。

1.6 多重PCR技术

1.6.1 多重PCR技术的定义及特点

多重PCR(multiplex PCR)是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，它最明显的优点是省时、省力、能够快速检测和鉴别病原体[20]，另外，多重PCR还可以精确地估计一个样品中模板数量。

1.6.2 多重PCR技术的应用

多重PCR技术将多个PCR反应放在同一个体系内，进一步提高了PCR反应的效率，它被广泛地用于病原体鉴别、性别鉴定、连锁分析、法医研究、模板检测和基因的疾病诊断等方面，高玉龙等[21]对烟草转基因进行了检测。

1.7 反向PCR技术

1.7.1 反向PCR技术的定义及特点

反向 PCR(reverse PCR)，又称为染色体缓移(chrornosome walking)[22]，它是指利用在已知序列内部没有切点的限制性内切酶对此段DNA进行酶切，在DNA连接酶作用下自连形成环状DNA分子，然后利用方向合适并与已知序列两端互补的引物，以连接成环的DNA为模板，经PCR扩增，得到已知序列的旁侧DNA片段。与常规PCR技术相比，反向PCR优势突出，但它需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切，另外，由于大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，在YAC或Cosmid的未知功能序列中有时也会存在这些序列，从而导致反向PCR得到的探针与多个基因序列杂交，影响扩增效果。

1.7.2 反向PCR技术的应用

反向PCR技术在检测病毒、转座子等在基因组中的整合位点，建立基因组步移文库及研究基因的上游调控元件等方面较常规PCR技术优势明显[22]，Souer等1995年将反向PCR技术与差别筛选法相结合，从矮牵牛W138中分离得到了高效转座子标签dTph1标记的基因。

1.8 锚定PCR技术

1.8.1 锚定PCR技术的定义及特点

锚定PCR(Anchored PCR)[23]，又称固定PCR，它以基因组总 DNA为模板，用一条基因特异性引物进行线性PCR扩增，产生单链扩增产物；在末端转移酶的作用下，在单链DNA分子的3’末端加上多聚胞嘧啶；用巢式基因特异性引物与多聚胞嘧啶配对的锚定引物对加尾的产物进行PCR扩增，PCR产物连入载体后进行测序鉴定。与常规PCR技术相比，锚定PCR技术特异性高、有较长的步行距离，一次实验可以获得1.5 kb左右的目的片段，同时它无需对基因组总 DNA进行限制性内切酶消化及连接反应，另外，其操作过程较其他方法简单，大约2-3个工作日就能完成。

1.8.2 锚定PCR技术的应用

锚定PCR技术解决了常规PCR技术所不能完成的已知片段侧翼序列的克隆问题，是常规PCR技术的又一重大扩展，贾小平等[24]用A-PCR对谷子微卫星文库进行了筛选。

1.9 兼并引物PCR技术

1.9.1 兼并引物PCR技术的定义

兼并引物PCR(degenerate primer PCR)是指针对由密码子的兼并性引起的，单以氨基酸顺序推测编码的 DNA序列的不精确性，设计成对兼并引物，通过PCR扩增所有编码已知顺序的核酸序列。

1.9.2 兼并引物PCR技术的应用

兼并引物PCR技术是常规PCR技术在蛋白领域的应用，具体表现在两个方面：(1)寻找新蛋白已被测定的一段氨基酸序列的相应基因；(2)寻找具有进化上保守结构域的蛋白质家族新成员的基因[25]。陶爱林等[26]采用该技术成功进行了蓰草花粉过敏原全长同源基因的克隆。

1.10 重组PCR技术及其应用

1.1 0.1 重组PCR技术的定义

重组PCR (recombinant PCR)是通过DNA重叠序列的衔接作用，使多个 DNA分子融合在一起的体外扩增技术[27]。它包括三个阶段：(1)制备用于重组的DNA组件；(2)组件分子作为引物互为模板延伸；(3)克隆和定向筛选重组产物[28]。

1.1 0.2 重组PCR技术的应用

重组PCR技术的出现，使常规PCR技术得到进一步扩展，它是PCR技术在核酸与蛋白两个领域应用的结晶。重组PCR技术的应用主要表现在：(1)精确解析大分子功能和相互作用的结构基础，如标定活性位点的关键残基、确认已知蛋白中未知功能的结构域、揭示配体-受体识别过程中相互临近的区域等。(2)探索顺式作用元件的调控机理，揭示mRNA的非翻译区的功能、确定启动子和增强子成分的功能等。(3)嵌合受体在研究信号途径和胞内定位中具有独特的“钓鱼”优势，用功能已知的分子和待研究对象嵌合来研究结合TGF之后的TGFR二聚化形式和内向整流型钾通道的脂筏定位过程[29,30]，(4)开发新型载体，比如通过DNA重排来增强绿色荧光蛋白 (GFP)的荧光稳定性；(5)升级分子标记，通过DNA改组已经获得的重组拟南芥K+转运蛋白可以使植株内的钾离子富集度提高26.1%；(6)重组 PCR在蛋白体外定向进化中的的应用最引人瞩目；(7)基于重组PCR技术的分子育种 (molecular breeding)在疫苗研发中有着广阔的应用前景，以HIV病毒疫苗研制为例，2002年运用DNA shufling技术突破了HIV的宿主专一性，得到了高复制率的嵌合猿-人免疫缺陷病毒(SHIV)[28]。

2 PCR技术在烟草领域的应用

2.1 烟草转基因的检测

烟草作为基因工程研究的模式植物，转基因体系已经很成熟，但是由于对转基因安全性不确定，目前我国还不允许种植转基因烟草。在转基因检测方法中，对转基因所用载体特异序列进行PCR扩增是最简单有效的，其精确度可达0.1%[21]，而多重PCR与锚定PCR[31]的应用使得这项检测更加简单、有效。

2.2 常规烟草病毒病的鉴定

我国烟区有15种病毒病危害烟草，不同病毒可能造成相似的症状，而不同条件下相同病毒也可能造成极为不同的症状，由于不同种类病毒在传播方式、流行规律和防治方法等方面差异较大，病毒种类的准确的鉴定是进行有效防治的前提。颜培强等2004年应用多重PCR原理建立了适于复合侵染病毒种类鉴定的PCR鉴定技术，采用荧光定量PCR技术建立了适于病毒定量研究的烟草病毒定量检测技术，为烟草病毒病药效防治效果评估和病毒在植株体内的消长规律研究提供了更为精确的检测方法。

3 展 望

PCR作为一项“革命性的技术”，不仅推动了遗传与分子生物学的发展，而且在其它领域科学家的努力与创新下，其不断与该领域的核心技术相结合，极大地推动了此领域的发展。另外，PCR技术从问世便成为生物学界的一大热点，它在烟草领域的应用由来已久，它的出现对烟草领域的研究者们造成了极显著的影响，同时也极大地促进了烟草领域的研究。总之，随着科学技术的不断进步，PCR技术必将得到新的发展，以之为基础的新技术将不断出现，它在烟草领域研究中的作用亦日渐明显。

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