噬菌体治疗结核病研究进展

于霞 黄海荣

(北京市结核病胸部肿瘤研究所 北京 101149)

噬菌体治疗结核病研究进展

于霞 黄海荣

(北京市结核病胸部肿瘤研究所 北京 101149)

细菌噬菌体(bacteriophage)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒,由F.d'Herelle(1917年)和 F.W.Twort(1915年)各自独立发现[1]。1947年,Gardner首次分离并命名了分枝杆菌噬菌体,至今已发现250多种分枝杆菌噬菌体。早在20世纪30年代,噬菌体已被尝试应用于感染性疾病的治疗,然而随着高效抗生素的大量开发,噬菌体治疗感染的作用逐渐被冷落,直到近年,由于各种致病细菌的耐药情况日趋严重,噬菌体治疗才又受到关注。随着对噬菌体研究的不断深入,目前已有60多种分枝杆菌噬菌体的全基因序列和特性被阐明[2],为噬菌体治疗分枝杆菌感染奠定了基础。本文拟对噬菌体在结核病治疗方面的研究予以综述。

1 噬菌体治疗结核病的发展历程和现状

1.1 噬菌体的分类和结构特点 根据噬菌体对其宿主菌的作用方式,可将噬菌体分为两类,即烈性噬菌体和温和性噬菌体[3]。烈性噬菌体感染敏感细菌后,可在其细胞内快速增殖并使之裂解,故又称毒性噬菌体。温和噬菌体侵入宿主细胞后,其核酸附着并整合在宿主染色体上与宿主核酸同步复制,但宿主菌不裂解反而继续生长。因此,从作用原理看,治疗用噬菌体以裂解型噬菌体为主。噬菌体颗粒在结构上分为三种类型：无尾结构的十二面体,如L5,D29,DS6A,TM4,Bxz2,Che9c等;有尾结构的二十面体,如I3和Bxz1;线状体。迄今已知的噬菌体大多是有尾结构的二十面体[4]。

1.2 噬菌体治疗作用的早期研究 噬菌体治疗细菌感染不是一个新概念。1921年,Bruynoghe和Maisin首次发表了噬菌体治疗人类葡萄球菌感染的报告,被感染的外科手术伤口可在应用噬菌体治疗后24～48 h内消退[5]。20世纪 30—40年代,美国一些大型医药公司也开发出治疗葡萄球菌和结肠杆菌等感染的噬菌体,但之后由于抗生素的出现和广泛应用,许多细菌感染能够得到快速有效控制,噬菌体治疗受到了冷落,西方国家停止了商业性生产,只有前苏联和一些东欧国家继续将之与抗生素一起使用[6]。

1.3 噬菌体质量新被关注的原因 随着抗生素的大范围应用以及误用和滥用,导致抗生素耐药现象严重。全球结核病例中 13.3%对异烟肼单耐药,0.6%对利福平单耐药,5.3%为耐多药(MDRTB)[7]。全世界每年新出现的 MDR-TB患者50万,XDR-TB[8]达到5万例。根据我国2007年全国耐药性结核病基线调查的情况推测,我国每年新发MDR-TB 12万,XDR-TB近1万。耐药结核病的广泛流行使得结核病的治疗陷入困境[9-10]。与此同时,非结核分枝杆菌(NTM)的感染也逐渐增多[11-12],中国基线调查NTM 获得率3.4%,广东报道高于20%。由于非结核分枝杆菌对大多数抗结核药物天然耐药[13],因此常用的抗结核药物疗效较差。基于以上原因,结核病的治疗需要开拓思路,寻求多渠道的治疗方式,由此应用噬菌体治疗结核病又受到关注。

1.4 噬菌体治疗结核的研究 噬菌体作为耐药结核的一种新的治疗方法,在体内和体外的治疗已取得初步的成效。Ranjan[14]等通过对6种已测序的分枝杆菌噬菌体 Che9c,D29,Bxz1,Bxb1,ω和TM4进行相对同义密码子分析,得出TM4是适合噬菌体疗法的杀菌最强的噬菌体。Broxmeyer[15]等在体外对大鼠腹腔巨噬细胞系建立结核和鸟分枝杆菌感染模型,然后用耻垢做载体携带 TM4到达感染的巨噬细胞,证实了TM4对于分枝杆菌的感染无论是预防还是治疗均有意义。Danelishvili等[16]对小鼠尾静脉攻毒建立鸟分枝杆菌感染模型,分别给予噬菌体、耻垢、耻垢-噬菌体治疗。结果单独噬菌体,单独耻垢组与空白对照组均差异无统计学意义,只有耻垢和TM4混合组细菌数量与对照组差异明显。实际上,48 h后耻垢-噬菌体组的细菌数量就下降100倍。黄新[17]等用超声波分散法把噬菌体制成脂质体包被液,对耐药结核菌小鼠模型行气管切开法滴入治疗,效果优于化疗组,治疗60 d转阴率为75%,治疗120 d转阴率87%。彭丽等[18]通过对小鼠大腿内侧皮下攻毒建立体表病灶,用滴鼻的方式给与噬菌体,治疗18 d体内出现噬菌体中和抗体,协同噬菌体杀灭病灶内的结核分枝杆菌。由此可见,噬菌体对于分枝杆菌的治疗在动物实验水平已经取得了明显的成效。

1.5 噬菌体的治疗价值 噬菌体治疗较其他方法治疗存在明显的优势。(1)指数增值：分枝杆菌噬菌体在体内也会以指数形式增值,由此可能减少后续给药,甚至是无需后续给药,因此维持血药浓度方面要优于抗生素。(2)不良作用小：噬菌体治疗具有特异性,只针对致病菌,很少有不良作用。Bruttin[19]等对15名健康受试者接受口服噬菌体治疗后,均无肝毒性,15人中仅有4例有轻微不良反应,3例胃肠道不适,1例喉咙疼痛。但噬菌体对于分枝杆菌的治疗尚处于动物实验阶段,对于噬菌体的安全性和不良反应尚需要进一步研究。(3)成本低：噬菌体只需通过简单的体外扩增就可获得,并且噬菌体在体外的保存相对稳定。彭丽等[20]对7种分枝杆菌噬菌体的扩增和保存条件进行研究,得出感染48 h后采用孵育-过滤方法收集的噬菌体效价高且方法简单。液体4℃保存的噬菌体稳定性好,在28周内噬菌体效价均未降低101数量级以上。因此,噬菌体治疗在成本方面也有很大优势。(4)与药物治疗或其他治疗的机制完全不同,不宜产生交叉耐药,可以与其他药物或治疗手段联合应用以提高疗效。

2 噬菌体治疗中需要关注的因素

2.1 噬菌体的宿主范围 噬菌体具有严格的宿主特异性,只寄居在易感的宿主菌体内,一旦离开宿主细胞噬菌体即不能生长又不能复制,但噬菌体的宿主范围是不可预测的[4]。Rybniker[21]等通过对14种分枝杆菌噬菌体在7H10培养基上能否形成噬菌斑来判定是否可以感染分枝杆菌,其中可以裂解结核分枝杆菌的噬菌体有Bxz2,D29,L5,TM4。TM4的宿主有耻垢,结核,BCG,溃疡;D29,Bxz2和 L5宿主范围很广,包括耻垢,结核,BCG,鸟,溃疡,另外L5和Bxz2还可以感染偶然和脓肿分枝杆菌。因为噬菌体具有严格的宿主特异性,在使用噬菌体治疗感染时,一定要明确感染的分枝杆菌菌种之后再进行个性化治疗。目前,在诊断方面应用较多的是D29,通过噬菌体生物扩增法检测临床标本中的结核分枝杆菌及对利福平的耐药性。在治疗方面应用较多是TM4,在体内外治疗分枝杆菌感染均取得了较好的疗效[15-16]。

2.2 不同给药途径对疗效的影响 噬菌体作为一种外源性微生物,机体存在清除体内噬菌体的趋势。如何提高噬菌体在机体内的半衰期将直接影响到治疗效果和重复给药间隔,而不同的给药途径与噬菌体的半衰期直接相关。针对肺结核,主要寄居于单核巨噬细胞内,因此要想使噬菌体有效地到达病灶,避免网状内皮系统的清除,必须要一种合适的载体将其保护然后转运到病灶[15-17]。针对肠结核,可以口服噬菌体。Chibani-Chennoufi[22]等通过口服噬菌体治疗由产肠毒大肠杆菌引起的腹泻,结果噬菌体只感染产肠毒的大肠杆菌,而对正常肠道菌落无影响。局部病灶直接给药,理论上避免了循环系统的免疫防御机制,被清除的可能性最小。

2.3 噬菌体治疗剂量的确定和是否需要重复给药噬菌体治疗致细菌感染必定存在2个途径：被动治疗和主动治疗。被动治疗与传统抗生素疗法相似,就是首次用量大,一次性杀伤敏感菌,但可根据需要重复追加用药。主动治疗是指噬菌体利用自身复制的优势在感染细菌后增殖,以达到持续治疗的目的。传统的抗生素用药越早越好,而噬菌体则不然。Payne等根据噬菌体治疗的动力学原理解释说,主动免疫会出现一种矛盾,就是噬菌体只有在细菌达到一定密度的时候才开始增殖,噬菌体接种过早或剂量不合适,可能会在开始增殖之前就被机体清除掉[23]。所以,确定最佳接种时间和剂量将成为噬菌体治疗的一大难题。

2.4 噬菌体抗性 如同抗生素治疗,是否产生噬菌体抗性也决定了此种治疗方式的连续性和有效性。噬菌体在感染细菌之前,首先要与细菌细胞壁的蛋白受体结合,然后将其DNA注射到细菌体内。因此,任何与这两个过程相关的基因突变都会导致噬菌体抗性的产生。通过对耻垢分枝菌耐D29菌株筛查,并未发现细胞壁受体的缺失,唯一的变化是mpr基因的过表达,而mpr基因可以阻止噬菌体DNA进入细菌。这种基因过表达也可以对噬菌体L5产生抗性,部分对 TM4抗性,但不影响Bxb1和I3感染[24]。因此,在使用噬菌体治疗前和治疗过程中,也应定期进行敏感性试验,及时了解噬菌体对细菌的杀伤活力。

3 噬菌体治疗的展望

噬菌体治疗结核病的研究虽然肯定了其疗效,但在真正应用于临床之前,还需要从多个角度出发,从多个方面改善噬菌体的治疗作用。主要涉及以下几个方面：

3.1 噬菌体基因重组 为了提高噬菌体的治疗效率,延长噬菌体在体内的半衰期,降低噬菌体治疗的不良作用,可以通过基因重组技术对噬菌体进行基因修饰。

3.1.1 提高疗效 对噬菌体的衣壳蛋白进行修饰,从而改变其药代动力学,生物分布和免疫原性,更好的治疗细菌感染。也可将噬菌体衣壳蛋白与药物偶联,一个药物分子可携带多个噬菌体,到达体内环境时,从药物中释放出来发挥杀菌作用[25]。

3.1.2 降低不良作用 一些噬菌体带有重组基因[26-28],如分枝杆菌噬菌体ch9c编码的蛋白gp60和gp61与大肠分枝杆菌中的recT和recE同源,分枝杆菌噬菌体HALO的gp43和 giles的gp53相似,但与rec类似蛋白较远,也可以介导同源重组。裂解型噬菌体在感染分枝杆菌时,会导致内毒素水平的增加,因此可以对温和型噬菌体进行基因重组,使之携带杀菌的基因,从而有效杀菌和减少内毒素的释放[29]。Hagen和 Bläsi[30]通过对 M13噬菌体进行基因重组,加入限制性内切酶BgⅢ基因或是经过修饰的噬菌体Holin基因,这种基因修饰的噬菌体在发挥高效的杀菌作用的同时又保持细菌细胞结构的完整,相对于裂解性噬菌体,内毒素的释放量大大减少。分枝杆菌噬菌体在治疗结核时,也可以对非裂解型噬菌体进行基因修饰,以达到有效杀菌又减少不良作用的目的。

3.1.3 改造使噬菌体能够不易被机体清除,即长效的噬菌体。通过对噬菌体进行改造,使其免受网状内皮系统的清除,从而延长在体内的存活时间,不需要反复用药,即可以保持有效地杀菌能力,因为噬菌体也具有预防结核的作用,体内的长效噬菌体也可以抑制持留菌。

3.2 给药途径的优化 使用噬菌体治疗感染时,要根据感染部位选择合适的给药途径,从而达到最佳治疗效果。针对肺结核,结核菌寄居于巨噬细胞,因此要想使噬菌体避免网状内皮系统的清除有效到达病灶,必须要一种合适的载体将其保护然后转运到病灶;针对结脑,能通过血脑屏障的抗结核药物很少,噬菌体能通过血脑屏障[31],可以考虑直接静脉注射的方式治疗。针对肠结核,可口服噬菌体并对其进行包被,只有达到肠道才能释放,尽可能减少胃酸杀伤作用;针对体表结核,可以采用局部皮下注射的方式或是制成合剂外敷,渗透到病灶内达到治疗的目的。

3.3 通过噬菌体特异位点开发新药 噬菌体的杀菌机制也为新药的研发提供依据。projan[32]认为与其利用噬菌体本身来治疗,还不如通过噬菌体的杀菌机制来研发新的抗生素。Liu[33]等对26种黄色葡萄球菌噬菌体进行测序,证实31种蛋白或多肽抑制细菌的生长。从噬菌体筛选出杀菌作用的靶蛋白,找到靶蛋白的小分子抑制剂,进而加工成有杀菌作用的抗生素。Rybniker[34]等通过分枝杆菌穿梭载体,证实了噬菌体 L5在复制初期的3种毒性蛋白抑制了耻垢分枝杆菌的生长。通过毒性多肽确定细菌细胞内的靶蛋白,就可以成为药物的作用位点。

4 结语

噬菌体治疗结核病的研究方兴未艾,已获得的数据都显示此种方法有效且具有一定的可行性。在比利时布鲁塞尔,医学伦理委员会于2007年批准医务工作者用噬菌体治疗由绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌引起的烧伤后感染[35]。虽然噬菌体对结核病的治疗还处于动物实验阶段,但在全球结核耐药现象严重和非结核分枝杆菌发病有所上升的背景下,噬菌体作为一种新的治疗手段,通过进一步研究可能具有广阔的应用前景。

[1]Broxmeyer L.Bacteriophages：antibacterials with a future?[J].M ed Hy potheses,2004,62(6)：889-893.

[2]Hatfull GF,Jacobs-Sera D,Lawrence JG,Pope WH,Russell DA,Ko CC,Weber RJ,Patel MC,Germane KL,Edgar RH,Hoyte NN,Bowman CA,T antoco AT,Paladin EC,Myers M S,Smith AL,Grace MS,Pham T T,O'Brien M B,Vogelsberger AM,Hry ckowian AJ,Wy nalek JL,Donis-Keller H,Bogel MW,Peebles CL,Cresawn SG,Hendrix RW.Comparative genomic analysis of 60 Mycobacteriophage genomes：genome clustering,gene acquisition,and gene size[J].mol biol,2010,397(1)：119-143.

[3]Lenski RE.Dynamics of interactions between bacteria and virulent bacteriophage[J].Adv Microb Ecol,1988,10：1-44.

[4]吴雪琼,张宗德,乐军.分枝杆菌分子生物学[M].北京：人民军医出版社,2010：54-57.

[5]Chanishvill N,Chanishvili T,T ediashvili M.Phages and their application against drug-resistant bacteria[J].Journal of Chemical T echnology and Biotechnology,2001,76：689-699.

[6]Clark JR,March JB.Bacteriophages and biotechnology：vaccines,gene therapy and antibacterials[J].Trends Biotechnol,2006,24(5)：212-218.

[7]Bergval IL,Schuitema AR,Klatser PR,Anthony RM.Resistant mutants ofMycobacterium tuberculosisselectedin vitrodo not reflect thein vivomechanism of isoniazid resistance[J].J Anti-microb Chemother,2009,64(3)：515-523.

[8]anerjee R,Allen J,Westenhouse J,Oh P,Elms W,Desmond E,Nitta A,Royce S,Flood J.Extensively drug-resistant tuberculosis in California 1993—2006[J].Clin Infect Dis,2008,47(4)：450-457.

[9]Fox W,Ellard GA,Mitchison DA.Studies on the treatment of tuberculosis undertaken by the British M edical Research Council tuberculosis units,1946—1986,with relevant subsequentpublications[J].Int J Tuberc Lung Dis,1999(10 Suppl2)：S231-279.

[10]O'Brien RJ,Nunn PP.The need for new drugs against tuberculosis[J].Am J Respir crit Care Med,2001,162：1055-1058.

[11]Cassidy PM,Hedberg K,Saulson A,McNelly E,Winthrop KL.Nontuberculous mycobacterial disease prevalence and risk facto rs：a changing epidemiology[J].Clin Infect Dis,2009,49(12)：124-129.

[12]Billinger ME,Olivier KN,Viboud C,de Oca RM,Steiner C,Holland SM,P revots DR.Nontuberculous mycobacteria-associated lung disease in hospitalized persons,United States,1998—2005[J].Emerg Infect Dis,2009,15(10)：1562-1569.

[13]akarova MV,Freǐ man GE.Study of the drug-sensitivity of nontuberculous mycobacteria[J].Probl T uberk Bolezn Legk,2009,7：55-58.

[14]Ranjan A,Vidyarthi AS,Poddar R.Evaluation of codon bias perspectives in phage therapy ofMycobacterium tuberculosisby multivariate analysis[J].In Silico Biol,2007,7(4-5)：423-431.

[15]Broxmeyer L,Sosnowska D,Miltner E,Chacón O,Wagner D,McGarvey J,Barletta RG,Bermudez LE.Killing of Mycobacterium avium andMycobacterium tuberculosisby a mycobacteriophage delivered by a nonvirulent mycobacterium：a model for phage therapy of intracellular bacterial pathogens[J].J Infect Dis,2002,186(8)：1155-1160.

[16]Danelishvili L,Young LS,Bermudez LE.In vivoefficacy of phage therapy for Mycobacterium avium infection as delivered by a nonvirulent mycobacterium[J].Microb DrugResis,2006,12(1)：1-6.

[17]黄新,高飞絮,常胜合,秦广雍,方华圣.噬菌体脂质体包被液治疗小鼠耐多药结核的初步研究[J].中国新药杂志,2008,17(6)：482-485.

[18]彭丽,罗永艾,陈保文,黎友伦,沈小兵,王国治.噬菌体对结核病模型豚鼠免疫功能的影响[J].医药导报,2006,25(8)：767-770.

[19]Bruttin A,Brǜssow H.Human volunteers receiving Escherichia coli phage T 4 orally：a sfety test of phage therapy[J].Antimicrob Agents Chemother,2005,49(7)：2874-2878.

[20]彭丽,罗永艾,沈小兵,王国治.分枝杆菌噬菌体生物学特性探讨[J].微生物学免疫学进展,2005,33(1)：19-23.

[21]Ry bniker J,K ramme S,Small PL.Host range of 14 mycobacteriophages in Mycobacterium ulcerans and seven other mycobacteria includingMycobacterium tuberculosis—application for identifyication and susceptibility testing[J].J Med Microbiol,2006,55(1)：37-42.

[22]Chibani-Chennoufi S,Sidoti J,Bruttin A,Kutter E,Sarker S,Brǜssow H.In vitroandin vivobacteriolytic activities ofEscherichia coliphages：implications fo r phage therapy[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(7)：2558-69.

[23]Platt R,Rey nolds DL,Phillips GJ.Development of a novel method of lytic phage deliveryby use of a bacteriophage P22 site-specific recombination system[J].FEMS Microbiol Let 2003,223(2)：259-265.

[24]Barsom EK,Hatfull GF.Characterization of My cobacterium smegmatis gene that confers resistance to phages L5 and D29 when overexpressed[J].Mol Microbiol.1996,21(1)：159-170.

[25]Yacoby I,Shamis M,Bar H,Shabat D,Benhar I.Targeting antibacterial agents by using drug-carrying filamentous bacteriophages[J].Antimicrob Agents Chemother,2006,50(6)：2087-2097.

[26]van Kessel JC,Hatfull GF.Recombineering inMycobacterium tuberculosis[J].Nat M ethods,2007,4(2)：147-152.

[27]van Kessel JC,Hatfull GF.Efficient point mutagenesis in mycobacteria using single-stranded DNA recombineering：characterization of antimy cobacterial drug targets[J].M ol Microbiol,2008,67(5)：1094-1107.

[28]van Kessel JC,Hatfull GF.Mycobacterial recombineering[J].MethodsMol Biol,2008,435：203-215.

[29]Westwater C,Kasman LM,Schofield DA,Werner PA,Dolan JW,Schmidt MG,Norris JS.Use ofgenetically engineered phage to deliver antimicrobial agents to bacteria：an alternatevetherapy for treatment of bacterial infections[J].Antimicrob Agents Chemother,2003,47(4)：1301-1307.

[30]Hagens S,Blä si U.Genetically modified filamentous phage as bactericidal agents：a pilotstudy[J].Lett Appl Microbiol,2003,37(4)：318-323.

[31]Barrow PA,Soothill JS.Bacteriophage therapy and prophy laxis：rediscovery and renewed assessment of potential[J].Trends Microbiol,1997,5(7)：268-271.

[32]Projan S.Phage-inspired antibiotics?[J].Nat Biotechnol,2004,22(2)：167-168.

[33]Liu J,Dehbi M,Moeck G,A rhin F,Bauda P,Bergeron D,Callejo M,Ferretti V,Ha N,Kwan T,M cCarty J,Srikumar R,Williams D,Wu JJ,Gros P,Pelletier J,DuBow M.Antimicroial drug discovery throug h bacteriophage genomics[J].Nat Biotechnol,2004,22(2)：185-191.

[34]Rybniker J,Plum G,Robinson N,Small PL,Hartmann P.I-dentification of three cy totoxic early proteins of mycobacteriophage L5 leading to growth inhibition in My cobacterium smegmatis[J].Microbiology,2008,154(8)：2304-2314.

[35]Verbeken G,De Vos D,Vaneechoutte M,Merabishvili M,Zizi M,Pirnay JP.European regulatory conundrum of phage therapy[J].Future Microbiol,2007,2(5)：485-491.

北京市科技新星计划(2007B039)

黄海荣(hairong.huangcn@gmail.com)

2010-02-08)

(本文编辑：张晓进)