鼻腔黏膜恶性黑色素瘤活化细胞外调节蛋白激酶表达及临床特征分析

李厚勇 周梁 王璟 丛宁

·临床研究·

鼻腔黏膜恶性黑色素瘤活化细胞外调节蛋白激酶表达及临床特征分析

李厚勇 周梁 王璟 丛宁

目的观察鼻腔黏膜恶性黑色素瘤活化细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)的表达，分析ERK活化与临床特征之间的关系。方法从20例鼻腔黏膜恶性黑色素瘤患者的肿瘤新鲜冻存组织中提取总蛋白，并采用蛋白印迹方法检测活化ERK的表达。对20例患者进行随访，观察肿瘤复发及颈淋巴结转移情况。结果20例鼻腔黏膜恶性黑色素瘤组织中，活化ERK表达阳性12例，其中9例术后复发，3例发生颈淋巴结转移；在8例活化ERK表达阴性患者中，2例术后复发，1例发生颈淋巴结转移。活化ERK表达阳性患者的复发情况高于ERK表达阴性的患者，差异有统计学意义(Plt;0.05)；而两者间颈淋巴结转移差异无统计学意义(Pgt;0.05)。结论鼻腔黏膜恶性黑色素瘤活化ERK表达阳性患者更易复发。(中国眼耳鼻喉科杂志，2011，11：30-32)

黑色素瘤； 鼻腔； 细胞外调节蛋白激酶； 复发； 转移

恶性黑色素瘤是恶性程度较高的一类肿瘤，好发于皮肤，原发于鼻腔鼻窦者较少。有学者[1-2]对皮肤恶性黑色素瘤进行研究，发现RAS-RAF-ERK途径信号转导通路在肿瘤的发生、发展、转移和复发中起着重要作用；但对鼻腔黏膜恶性黑色素瘤中RAS-RAF-ERK信号转导通路及该通路与肿瘤的临床特征间联系的研究少有报道。本研究拟采用蛋白印迹法检测鼻腔黏膜恶性黑色素瘤中持续活化的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)，观察活化ERK在肿瘤组织中的表达情况，并与肿瘤的临床特征进行比较，以期发现活化ERK的表达与肿瘤临床特征之间的联系。

1 资料与方法

1.1 资料 2005年12月至2009年6月我科收治的鼻腔黏膜恶性黑色素瘤手术患者20例,其中男性13例、女性7例；年龄40～75岁，平均55.8岁。临床表现为鼻塞18例，涕中带血15例，鼻出血5例。鼻内镜检查：鼻腔内褐色或黑色肿物，表面不光滑。病理活组织检查提示鼻腔黏膜恶性黑色素瘤。所有患者均行手术治疗，其中13例行鼻侧切开术，5例行部分上颌骨截除术，2例行上颌骨截除术；2例同时行颈廓清术，2例术后半年出现颈淋巴结转移而行颈廓清术。术中取20例新鲜肿瘤组织并液氮冻存，作为实验标本。术后病理及免疫组织化学证实为恶性黑色素瘤。以眶外伤行鼻内镜手术患者的鼻腔黏膜作为健康对照组。按照术中所见的肿瘤范围及CT诊断情况，根据国际抗癌协会TMN分类标准(1997)，对20例患者进行肿瘤分期，其中2期3例、3期13例、4期4例。所有患者术后随访1～3年。

1.2 方法 仪器及试剂：Allegra 25R冰冻离心机 (贝克曼生物公司)，胶片分析仪(上海天能公司)，紫外分光光度计(HACH公司，美国)，总蛋白抽提液(上海普飞生物公司)，兔抗人磷酸化ERK抗体 (Cell signaling technology公司)，丙烯酰胺(Sigma公司，美国)，酶标二抗 (Sigma公司，美国),硝酸纤维素膜(Whatman公司)。

切取液氮冻存标本100 mg,迅速研磨粉碎；然后加300～500 μL 细胞裂解液( 磷酸盐缓冲液内加蛋白酶和磷酸化酶抑制剂)裂解细胞, 以6 500 ×g离心10 min (r=15 cm,4 ℃)；取上清液测蛋白浓度,并调整各样本浓度一致。然后采用蛋白印迹法；经蛋白电泳、蛋白质转印、抗体偶联物免疫检测和放射自显影等步骤，测定鼻腔黏膜恶性黑色素瘤组织中活化ERK1/2蛋白的表达水平。

1.3 统计学处理 采用精确χ2检验对本组数据进行统计学处理，以Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

20例鼻腔黏膜恶性黑色素瘤中，有12例活化ERK表达阳性；鼻腔黏膜正常组织中无活化ERK表达(附4页图①)。12例活化ERK表达阳性患者中，伴颈淋巴结转移3例，术后复发9例；8例活化ERK表达阴性患者中，伴颈淋巴结转移1例，术后复发2例。经精确χ2检验，两组间颈淋巴结转移差异无统计学意义(P=0.363 26)；活化ERK表达组的术后复发病例数高于无活化ERK表达组，两组间差异有统计学意义(P=0.036 68)。

12例活化ERK表达患者中，肿瘤分期2期2例，3期8例，4期2例；8例无活化ERK表达患者中，肿瘤分期2期1例，3期4例，4期2例。经χ2检验，结果显示ERK表达与肿瘤分期间差异无统计学意义(χ2=1.135，Pgt;0.05)。

3 讨论

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)是一系列丝氨酸/苏氨酸激酶，可磷酸化其他细胞质蛋白，并从胞质移位至细胞核而调节转录因子的活性。在人类细胞内，高度保守的MAPKs是信号从细胞表面转导至细胞核内部的重要传递者，主要参与胚胎发育、细胞分化、细胞增殖和细胞死亡的过程。在MAPKs家族中[3-5]，ERK是最先发现并被了解最多的成员。ERK包括两种异构体：ERK1和ERK2(分别为p44和p42)。许多丝裂原可激活ERK级联反应，如上皮生长因子、血小板衍生生长因子、血栓素A2、血管紧张素、转化生长因子和胰岛素等。生长因子与细胞表面的受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)结合，诱发生长因子受体胞质中的酪氨酸残基自主磷酸化，导致受体二聚体化与活化。磷酸化的酪氨酸残基可以与生长因子受体结合蛋白2(Grb2)结合，并通过该蛋白的SH2结构域与鸟嘌呤核苷酸交换因子(Sos)形成复合物。细胞表面的生长因子受体具有募集Grb2与Sos复合物的能力。Sos与生长因子受体结合的过程中，移位至胞质并与RAS相互作用，促进RAS与GTP结合，从而使RAS被激活而成为具有功能活性的RAS蛋白。GTP偶联的RAS蛋白能与RAF结合，并以一种目前未知的作用方式激活RAF蛋白。活化的RAF蛋白即MAPK激酶激酶(MAPKKK)可以磷酸化并激活MAPK激酶(MEK)，活化的MEK可以进一步磷酸化并活化ERK1/2[4-5]。

目前研究发现，RAS-RAF-MAPK信号转导通路在皮肤恶性黑色素瘤的发生、发展中起着重要作用[6-11]。癌基因RAF可以调控Raf 蛋白的合成，Raf蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。活化的RAF蛋白可以激活MAPK信号通路，导致ERK1/2的持续活化[3，5,12]。ERK是MAPK/ERK路径的效应子[13],活化的ERK可以磷酸化ELK-1 ( Ets like transcription factor-1)、c-FOS、c-JUN、NF-κb(nuclear factor of kappa b)等蛋白[5，13],在细胞多种正常生理过程中(如细胞生长、发育、分裂、死亡等)发挥作用。ERK过度活化后,还可通过影响cyclin、MITF (microphthalmia- associated transcription factor)、MMP (matrix metalloprotease)等因子促使细胞生长过度和分化不良,致细胞间黏附力下降，促进肿瘤的发展[4-5，13]。

本研究发现，在鼻腔黏膜恶性黑色素瘤中，ERK1/2的活化率达60%，而正常鼻腔黏膜组织中无活化的ERK，说明ERK信号通路的持续活化与鼻腔黏膜恶性黑色素瘤的发生、发展有较为密切的关系。结合本文随访结果，在12例活化ERK表达的鼻腔黏膜恶性黑色素瘤患者中，术后复发9例，伴颈淋巴结转移者3例；而在8例无活化ERK表达的患者中，术后复发2例，伴颈淋巴结转移者1例。经χ2检验，两组间在术后复发率上差异有统计学意义，而在颈淋巴结转移率上差异无统计学意义，提示活化ERK与鼻腔黏膜恶性黑色素瘤的复发关系密切。12例活化ERK表达患者中，肿瘤分期2期2例，3期8例，4期2例；8例无活化ERK表达患者中，肿瘤分期2期1例，3期4例，4期2例。采用χ2检验，两组间在肿瘤分期间的差异无统计学意义。本文研究提示，可以通过检测ERK的活性，推测鼻腔黏膜恶性黑色素瘤的复发可能，并对恶性黑色素瘤复发的早期发现和干预提供新的研究方向和思路。

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2010-10-11)

(本文编辑 杨美琴)

·消息·

第48届国际临床视觉电生理协会年会在澳大利亚召开

第48届国际临床视觉电生理协会(ISCEV)年会于2010年11月6—10日在澳大利亚西部城市珀斯的Fremantle举行，来自26个国家的300多名代表出席了本次年会。代表们就视觉电生理各个方面的内容以大会发言、展板和病例讨论等形式进行了广泛深入的交流探讨。本次年会Emiko Adachi Award Lecture的演讲嘉宾是日本名古屋爱知医科大学的Yozo Miyake教授，他作了题为“建立完全型和非完全型先天性静止性夜盲以及隐匿性黄斑营养不良临床新概念”的演讲。澳大利亚国立大学的Trevor Lamb教授做了“视网膜电图不同成分的细胞来源”的主题演讲。美国密西根大学的Heckenlively教授应邀做了“预后因素在Stargardt病临床分析和表型间的关系”的专题报告。多焦视觉电生理发明人Erich Sutter教授的专题讲座是“探索视觉电生理新的可能性”。大会发言交流的主要内容涉及视觉电生理在神经眼科的应用，多焦电生理技术进展，影响视觉系统的药物毒性监控，儿童电生理，视觉电生理扩展程序的应用，视网膜疾病的电生理、基因和影像学，动物模型的电生理和影像学等方面。专为鼓励青年科学家设立的Eberhard Dodt Memorial Award，今年授予来自澳大利亚墨尔本的Yu Xiang George Kong。年会还就2013年第51届ISCEV年会的地点让参与竞选的中国重庆和新加坡作了参选介绍，香港中文大学的赖旭佑教授代表中国作了精彩的申办陈述，中华眼科学会视觉生理组组长阴正勤教授代表中华眼科学会主任委员赵堪兴教授向各位代表发出热情邀请。新加坡的代表也作了富有吸引力的陈述。按照协会规定，最后当选的举办城市由所有会员投票决定。

本次年会在主办方的精心安排下取得圆满成功，会议学术气氛浓厚，与会者在充分学习交流的同时，也享受东道主的热情好客。传统的ISCEV奥林匹克竞赛为紧张的会议安排增添不少轻松，愉快的气氛，中国代表参与的亚洲队喜获铜奖。

王敏

Analysisofextracellularregulatedproteinkinaseactivationandclinicalcharacteristicsinpatientswithnasalmucosamelanomas

LIHou-yong,ZHOULiang,WANGJing,CONGNing.DepartmentofOtorhinolaryngology,EyeEarNoseandThroatHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China

Corresponding author：LI Hou-yong,Email:lihouy2000@yahoo.com.cn

ObjectiveTo determine the expression of activated extracellular regulated protein kinases (ERK) and to analyze the relationship between the ERK activation and clinical characteristics in patients with nasal mucosa melanomas.MethodsTwenty nasal mucosa melanomas samples were collected. Total protein was obtained and the activated ERK was detected by Western blot. These patients were followed-up for 1 to 3 years.ResultsThe phosphorylated ERK protein was detected in 12 samples. In 12 patients with ERK activation, the recurrence and cervical lymph node metastasis after surgery was observed in 9 cases and 3 cases respectively. In 8 patients without ERK activation, the recurrence and cervical lymph node metastasis after surgery was observed in 2 cases and 1 case respectively. There was a significant difference in recurrence (Plt;0.05), but not in cervical lymph node metastasis (Pgt;0.05) between patients with or without ERK activation.ConclusionsIn nasal mucosa malignant melanomas, the recurrence in patients with ERK activation was possibly more than that in patients without ERK activation.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2011,11:30-32)

Melanoma; Nasal; Extracellular regulated protein kinases; Recurrence; Metastasis

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科 上海 200031

李厚勇(Email：lihouy2000@yahoo.com.cn)