川芎嗪对人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP的逆转作用研究*

刘明华,任美萍,李 蓉,章 卓,肖顺汉

(泸州医学院药理教研室,四川泸州 646000）

肿瘤化疗新的治疗手段中,耐药逆转剂是一类很有实用价值的新型药物,它们能增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,从而提高药物疗效[1]。顺铂(cisplatin,DDP)为一广谱、高效抗癌药,对卵巢癌、睾丸癌、头颈部癌及肺癌均有较高疗效,但由于耐药性的产生使其不能发挥应有的作用,常常导致化疗失败[2-3]。因此,提高卵巢癌的化疗敏感性,降低化疗耐药尤其是对最常用的化疗药物顺铂的耐药性是改善临床预后的关键[4-5]。本研究采用人卵巢癌细胞株COC1为诱导对象,采用逐步递增DDP浓度、间歇作用的体外诱导法,建立人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP,并研究川芎嗪对COC1/DDP顺铂耐药性的逆转作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 川芎嗪(tetramethy lpy razine),无色针状结晶,纯度大于或等于98%,由上海楚柏实验室设备有限公司提供。精确称取川芎嗪100mg,溶于10 m L单 RPM I-1640培养液,以0.22 nm超滤除菌器过滤除菌,制成10 mg/m L的川芎嗪浓缩含药培养液,临用前用培养液稀释备用。顺铂注射液来自云南个旧生物药业有限公司,RPM I-1640为Gibco公司产品,胰蛋白酶为美国Sigma公司产品,胎牛血清为天津灏洋生物制品科技责任有限公司产品,CCK-8(cell counting kit-8)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和GSSG试剂盒为碧云天生物技术研究所产品。

1.2 细胞株 亲代卵巢癌细胞COC1来自分化差的人卵巢腺癌患者的癌性腹水,由中国医学科学院肿瘤所1993年建株,由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供。采用含10%胎牛血清的RPM I-1640、pH 7.4完全培养基,在 37℃、5%CO2条件下常规培养。

1.3 耐药细胞系耐药性的建立 COC1细胞采用含10%胎牛血清的RPM I-1640完全培养基,37℃、5%CO2条件下常规培养,细胞呈悬浮生长。待生长稳定后,取对数生长期COC1细胞培养在含DDP的RPM I-1640培养液中,逐步提高DDP浓度间歇诱导,剂量为 0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 μg/m L,最终获得1株能完全耐受1.0μg/m L DDP的细胞株,细胞诱导成功后,将细胞在无药物的培养基中培养1个月,再进行各项实验。

1.4 COC1/DDP对各种抗癌药的耐药指数 取对数生长期的COC1/DDP细胞制成细胞悬液,细胞浓度 1×105/m L,接种于96孔板,每孔90μL,空白孔加入90μL RPM I-1640,并加入终浓度分别为 0.01、0.1、1、10、100 μg/m L 的顺铂、卡铂、长春新碱、阿霉素等4种抗癌药物,每一浓度重复3孔,阴性对照组加等体积无血清RPM I-1640,并设空白对照组,置37℃,5%CO2孵箱内培养48 h后每孔加入CCK-8继续培养1 h,酶标仪450 nm波长下检测各孔吸光度A值,按下列公式计算抑制率:细胞增殖抑制率=[1-(A给药组-A空白孔)/(A 阴性对照组-A空白孔)]×100%,LOGIT法计算各种抗癌药物的半数抑制浓度(IC50)及耐药指数(resistance index,RI),RI=IC50(耐药细胞)/IC50(亲本细胞)。

1.5 细胞生长曲线和群体倍增时间测定 将5×104/m L对数生长期单细胞悬液接种至24孔培养板中,37℃,5%CO2条件下培养。每日取3孔细胞进行计数,连续观察7 d。以培养时间为横轴,细胞数为纵轴绘制细胞生长曲线,并按Patterson公式计算群体倍增时间(doubling time,TD)。TD=T×log2/(logNt-logN0)(其中N0为初始细胞数,Nt为终末细胞数,T为Nt-N0时间)。

1.6 川芎嗪对COC1/DDP顺铂耐药性的逆转作用

1.6.1 最适逆转浓度的确定 将不同浓度的川芎嗪(1、0.5、0.25、0.125、0.062 5mg/m L)加入96孔板,测定细胞存活率,确定川芎嗪对COC1/DDP的毒性作用,以COC1/DDP细胞存活率大于或等于90%作为最适逆转浓度。

1.6.2 对COC1/DDP顺铂耐药性的逆转作用 COC1/DDP细胞按1×105/m L接种至 96孔培养板,经24 h培养后,每孔加药10μL。对照组加入不同浓度DDP,逆转组加入川芎嗪最适逆转浓度和不同浓度DDP的混合液(对照组和逆转组DDP的终浓度分别为 0.01、0.1、1、10、100 μg/m L)。阴性对照组每孔加入磷酸盐缓冲液(PBS)10μL,并设空白对照。置37℃,5%CO2培养箱内培养 48 h后加入CCK-8 10μL,继续培养1 h,酶标仪450 nm波长下检测各孔吸光度 A450值,计算IC50及逆转倍数。

1.7 细胞内GSH水平测定 将 COC1、COC1/DDP及经川芎嗪最适逆转浓度预处理12 h的COC1/DDP细胞,按GSH和GSSG检测试剂盒说明书检测细胞内GSH的含量。

1.8 高效液相色谱仪测定细胞内顺铂含量 取 COC1、COC1/DDP及经川芎嗪最适逆转浓度预处理12 h的COC1/DDP细胞,在含有 5μg/m L顺铂培养液中培养4 h,用冷PBS洗2次,2 700 r/m in离心5 min,然后用高效液相色谱测定细胞内顺铂的含量(顺铂的浓度用测定每1×106个细胞中的顺铂量表示)。色谱条件为:氨基键合硅胶柱,二甲基甲酰胺为样品溶剂,流动相为乙酸乙酯∶甲醇∶二甲基甲酰胺∶水(25∶16∶5∶5,V/V/V/V),在310 nm 检测,流速 1.5 m L/m in,进样量20μL。

2 结 果

2.1 COC1/DDP耐药细胞株的建立及多药耐药特征 历时5个月获得了1株在1.0μg/m L DDP作用于生长良好的耐药细胞株COC1/DDP,CCK-8试剂盒检测表明COC1/DDP细胞对顺铂的 IC50值为 COC1细胞的 9.44倍,并对卡铂(Carbop latin)、长春新碱(VCR)和阿霉素(ADM)的耐药性也提高了约2～5倍不等(表 1)。

2.2 COC1和COC1/DDP细胞生长曲线和倍增时间 COC1和COC1/DDP细胞的生长曲线(图1)。COC1细胞的倍增时间为(32.99±0.20)h,COC1/DDP细胞的倍增时间为(40.15±0.54)h,耐药细胞的倍增时间延长1.22倍。

2.3 川芎嗪对COC1/DDP顺铂耐药性的逆转作用 川芎嗪单独应用,低浓度对COC1/DDP几无明显毒性作用,在0.25 mg/m L时对COC1/DDP细胞的抑制率为接近10%,因此将川芎嗪在0.25 mg/m L设为该药物的最适逆转浓度。DDP单独作用于COC1/DDP细胞时 IC50为(9.63±0.24)μg/m L,但当川芎嗪0.25 mg/m L与不同浓度的DDP合用时DDP的IC50为(2.56±0.02)μg/m L,逆转倍数达到3.76倍,结果见表2。

2.4 细胞内GSH水平及顺铂含量的变化 与COC1比较,COC1/DDP细胞内 GSH的水平增高,顺铂含量下降,但经0.25 mg/m L川芎嗪干预后,COC1/DDP胞内的GSH的水平降低,顺铂的含量增加(P＜0.01)。结果见表3。

表1 药物对COC1和COC1/DDP细胞的半数抑制浓度(±s,n=3)

表1 药物对COC1和COC1/DDP细胞的半数抑制浓度(±s,n=3)

*:P＜0.05,**:P＜0.01,与COC 1比较。

细胞IC50(μg/m L)顺铂 卡铂 长春新碱 阿霉素COC1 1.02±0.07 1.39±0.02 48.50±1.82 2.03±0.29 COC1/DDP 9.63±0.24** 6.41±0.11** 79.67±0.95** 10.05±0.07**耐药指数(RI) 9.44 4.61 1.64 4.95

表2 川芎嗪对COC1/DDP顺铂耐药性的逆转作用(±s,n=3)

表2 川芎嗪对COC1/DDP顺铂耐药性的逆转作用(±s,n=3)

*:P＜0.05,**P＜0.01,与单用顺铂比较。

组别抑制率(%)DDP 0.01μg/m L DDP 0.1μg/m L DDP 1 μg/m L DDP 10μg/m L DDP 100μg/m L单用顺铂 0.14±0.04 1.23±0.16 12.06±0.13 48.15±3.14 90.35±0.55顺铂+川芎嗪 4.93±0.03** 12.86±1.56* 25.03±1.13** 57.40±3.52** 94.46±1.20**

表3 川芎嗪对细胞内GSH和顺铂含量的影响(±s,n=3)

表3 川芎嗪对细胞内GSH和顺铂含量的影响(±s,n=3)

*:P＜0.05,**:P ＜0.01,与 COC1 比较;Δ:P ＜0.05,ΔΔ:P ＜0.01,与COC1/DDP比较。

项目 COC1 COC1/DDP COC1/DDP+川芎嗪GSH(nmol/106 cells) 4.37±0.32 12.44±0.50** 6.23±0.70**Δ顺铂(ng/106 cells) 49.57±2.78 25.03±3.81** 34.88±1.86*ΔΔ

图1 COC1和COC1/DDP细胞的生长曲线(n=3)

3 讨 论

多药耐药(multid rug resistance,MDR)是指肿瘤细胞一旦对某种化疗药物产生耐药性,同时对其他结构无关、作用机制亦各异的药物也产生交叉耐药性,这是一种独特的广谱耐药现象,是导致肿瘤化疗失败的最主要原因[6]。本研究采用逐步递增DDP浓度、体外间歇诱导法诱导人卵巢癌细胞系COC1,建立了1株在1.0μg/m L DDP作用下生长良好的耐药细胞株COC1/DDP,耐药指数为9.44,而且COC1/DDP对卡铂、长春新碱和阿霉素的药物敏感性也有不同程度的降低,说明COC1/DDP细胞具有多药耐药性。同时实验表明,与亲代细胞COC1比较,COC1/DDP细胞中GSH的含量明显增高,顺铂的含量明显降低(P＜0.01),说明COC1/DDP的耐药机制可能与GSH/GST-π解毒系统活性增强,使细胞内顺铂主动外排增加有关。

川芎嗪为中药川芎的主要成份,与维拉帕米相似,具有钙离子通道阻滞剂活性,临床上多用于心、脑血管疾病的治疗。近年来发现川芎嗪可部分纠正阿霉素对小鼠腹水癌的抗药性[7],逆转肿瘤细胞株KBV 200多药耐药性[8],以及对 HL-60/VCR细胞株及肺癌细胞SPCA-1/ADM的MDR有逆转作用[9]。Versantvoort等[10]研究表明,在顺铂耐药的卵巢癌细胞株中常发现谷胱甘肽(GSH),GSH全称L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酸-甘氨酸,GSH含量增加与细胞对铂类的耐药程度相平行,顺铂耐药与胞质中GSH水平的相关系数高达0.96。GSH可能从以下几个方面参与了肿瘤细胞耐药机制的形成:(1)GST-π可催化GSH与亲电性抗癌药物迅速结合,加速抗癌药物的降解,使药物在靶部位的积蓄量迅速减少,从而达不到致死浓度[11-12]。(2)GST-π可催化亲脂性抗癌药物与胆红素及甾体化合物等结合,加速药物的排泄,并保护膜脂质成分不被自由基等损伤。(3)GSH作为还原剂还原某些细胞毒性代谢产物。(4)GST-π可催化GSH与细胞核内“药物-DNA”单一功能复合物结合,阻止其形成具有细胞毒性的双功能复合物(如铂-DNA复合物),并且加强对损伤DNA的修复能力,从而使抗肿瘤药物的细胞毒性降低[13-14]。(5)GST-π在癌细胞内表达水平及活性增加,使抗肿瘤药物降解加速,排泄加快,细胞内有效药物浓度持续时间缩短,相应地缩短了抗肿瘤药物有效地作用于靶部位的时间,从而降低抗肿瘤药物的细胞毒性[15-16]。

本研究应用川芎嗪对人卵巢癌细胞COC1/DDP的生长进行观察,其 IC50值均有明显下降,说明川芎嗪对 COC1/DDP细胞有明显的逆转作用,加入川芎嗪后COC1/DDP胞内GSH含量明显下降,顺铂的含量却明显增加(P＜0.01)。因此,川芎嗪的逆转作用可能与影响COC1/DDP胞内GSH/GST-π解毒系统有关,同时也进一步明确了GSH/GST-π解毒系统在肿瘤多药耐药性和抗癌药物外排的重要作用。

[1] Li X,Ling V,Li PC.Same-sing le-cell analysis for the study of drug efflux modu lation of mu ltid rug resistant cells using a microfluidic chip[J].Anal Chem,2008,80(11):4095-4102.

[2] 陈建利,江森,杨瑞芳,等.人卵巢上皮性癌顺铂耐药细胞系3A 0/cDDP模型的建立及耐药机理的实验研究[J].现代妇产科进展,2000,9(3):178-180.

[3] Poon RT,Fan ST,W ong J.Risk factors,prevention and management of postoperative recurrenceafter resection of hepatocellular carcinomaj[J].Ann Surg,2000,232(1):10-12.

[4] 吴翠芳,曾嵘,周于禄,等.芦荟大黄素对人肺腺癌细胞顺铂多药耐药性的逆转作用[J].中国医院药学杂志,2008,28(13):1061-1062.

[5] 刘振洋,陶一明,向芳,等.不同温度热疗逆转人肺癌细胞A 549/CDDP耐药性的研究[J].肿瘤基础与临床,2009,22(3):189-192.

[6] 靳胜,陈书恩,张曼,等.姜黄素逆转H L60/ADR及MCF-7/ADR的多药耐药研究[J].重庆医学,2010,39(1):21-23.

[7] 胡艳平,刘健,王庆端,等.川芎嗪和维拉帕米纠正阿霉素对小鼠艾氏腹水癌的抗药性[J].药学学报,1993,28(1):75-78.

[8] 徐建业,周琦,汤伟.汉防已甲素、罗通定及川芎嗪对肿瘤细胞株KBV200多药耐药性逆转作用的研究[J].重庆医学,2005,34(9):1383-1386.

[9] 戚晓敏,单根法,张辅贤,等.川芎嗪逆转肺癌细胞株多药耐药性的研究[J].上海第二医科大学学报,2003,3(1):31-33.

[10]Versantvoort CH,Brox terman HJ,Baw j T,eta1.Regu lation by g lutathione of d rug transport in mu lfid rug-resistant human lung turnout cell lines overexpressing multid rug resistance-associated protein[J].Br JCancer,1995,72(1):82-89.

[11]Zhang T,Guan M,Jin HY.Reversal of multidrug resistance by small interfering doub le-stranded RNAs in ovarian cancer cells[J].Gynecol Oncol,2005,97(2):501-507.

[12]梁蓉,杨平地,陈协平,等.川芎嗪对白血病HL-60/VCR细胞多药耐药的逆转及其机制的研究[J].中华血液学杂志,1999,20(6):323-326.

[13]印国兵,孙治君,郭丹,等.Pgp、MRP1和GST介导乳腺癌细胞对As2O3耐药的初步研究[J].重庆医学,2010,39(7):812-814.

[14]Lewandowicz GM,Bfitt P,Elgie AW,et a1.Cellu lar g lutathione content,in vitro chemoresponse,and the efect o f BSO modulation in sam pies derived from patients with advanced ovarian cancer[J].Gynecol Oncol,2002,85(2):298-304.

[15]王玲,刘世坤,周于禄,等.华蟾素对人乳腺癌细胞阿霉素多药耐药性的逆转作用[J].中国药理学通报,2007,23(5):677-680.

[16]W ang LS,Chow KC,W u YC,et a1.Inverse expression of dihyd rodiol dehydrogenase and glutathione-S-transferase in patientsw ith esophageal squamous cell carcinoma[J].Int JCancer,2004,111(2):246-251.