P2Y2受体在人涎腺及腺样囊性癌中的表达

高 璐,柴松岭,张福胤

(1.大连医科大学口腔医学院 辽宁大连 116044;2.大连医科大学附属第一医院 口腔科辽宁 大连 116011)

P2Y2受体在人涎腺及腺样囊性癌中的表达

高 璐1,柴松岭1,张福胤2

(1.大连医科大学口腔医学院 辽宁大连 116044;2.大连医科大学附属第一医院 口腔科辽宁 大连 116011)

[目的]探讨P2Y2受体在涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)中表达的临床意义。[方法]应用免疫组织化学方法检测P2Y2受体在 49例 SACC和肿瘤周边涎腺组织中的表达及分布,利用显微镜图像分析技术测定 P2Y2受体表达的平均灰度值,统计学分析两组该受体表达量的差异。[结果]SACC中P2Y2受体表达的平均灰度值为 12.73±7.59,显著高于肿瘤周边涎腺组织的 3.76±1.82(P＜0.05)。SACC实性型的表达平均灰度值高于腺样 -管状型,Ⅲ～Ⅳ期高于Ⅰ～Ⅱ期,神经侵袭型高于非神经侵袭型,以上分组中两组间差异均具有统计学意义。[结论]SACC中 P2Y2受体表达与肿瘤的恶性程度呈正相关性。

涎腺肿瘤;腺样囊性癌;P2Y2受体;ATP;免疫组织化学

嘌呤受体 P2Y是一类 G蛋白偶联受体,具有七次跨膜结构,迄今已从人体组织细胞中克隆出 9种P2Y受体亚型,在体内各种组织广泛分布,功能各异。不同亚型 P2Y受体通过 G蛋白激活不同胞内信号传导通路,执行特定的生理功能。大量文献报道丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase,MAPK)通路在细胞生长、恶性转化及侵袭转移中起关键作用,而 P2Y受体活化可以激活 MAPK信号通路,并促进前列腺癌细胞的体外侵袭[1];研究证实高浓度的ATP通过活化P2Y1受体诱导人小肠上皮癌细胞凋亡,而低浓度的 ATP或 UTP通过刺激P2Y2受体诱导其增殖,故认为嘌呤受体的活化或功能降低可以部分介导上皮癌细胞的增殖和凋亡[2]。目前,关于 P2Y受体在涎腺上皮性肿瘤中发挥的作用尚缺乏研究。

1 材料和方法

1.1 标本来源

收集临床涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)石蜡病理标本 49例,患者年龄介于 40～70岁。其中,男 23例,女 26例;腮腺肿瘤 22例,颌下腺肿瘤 11例,舌下腺肿瘤 3例,腭部及其它小涎腺肿瘤 13例;49例石蜡标本均有肿瘤周边正常腺体组织。SACC标本来自大连医科大学附属第一医院口腔颌面外科病房 1995年 ～2010年手术病例,所有标本均经过病理科确诊。

1.2 主要试剂

P2Y2受体一抗为兔抗人多克隆抗体,购自 Santa Cruez公司。免疫组化 SP检测试剂盒、柠檬酸组织抗原修复液、DAB显色剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。主要试剂的配制：P2Y2受体抗体稀释度为 1∶50。

1.3 分 组

第 1组：人正常涎腺组织 49例;第 2组：涎腺腺样囊性癌 49例。SACC进行分组：A组,根据 WHO(1991)病理分型：A1组：腺样 -管状型 32例;A2组：实性型 17例。B组,根据 UICC(2002)TNM临床分期：B1组：Ⅰ ～Ⅱ期 36例;B2组：Ⅲ ～Ⅳ期 13例。C组,根据肿瘤细胞是否侵犯神经(即发现神经受侵袭或癌细胞包绕神经生长判定为阳性)：C1组：非神经侵袭型 35例;C2组：神经侵袭型 14例。

1.4 免疫组化染色和光镜下观察结果

在 200倍视野下,每张切片在正常涎腺组织及肿瘤中分别随机选取 10个视野,测定每个视野的累积灰度值(d)和组织面积(s),用总累积灰度值(D)除以总组织面积(S),计算出每例正常涎腺组织及腺样囊性癌的平均灰度值(x)。

1.5 统计学方法

采用 SPSS 11.5统计软件对所得数据进行统计学分析。计量数据以均值 ±标准差(±s)表示,P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结 果

2.1 P2Y2受体在人正常涎腺组织中的表达

人正常涎腺组织中,腮腺 22例,颌下腺 11例,舌下腺 3例,腭部及其它小涎腺 13例。P2Y2受体表达主要分布在导管细胞和腺泡细胞(以浆液腺腺泡为主)的胞核及核膜中,核膜着色较深,呈棕褐色,核内着色不均匀,细胞浆中亦有少量表达,呈不均匀的浅棕色;梭形肌上皮细胞未见表达(图 1)。P2Y2受体在 49例正常涎腺组织中表达的平均灰度值为3.76±1.82。

2.2 P2Y2受体在 SACC中的表达

P2Y2受体主要分布在未分化、体积较小、核较大且异形性明显的基底样和导管样上皮性肿瘤细胞的胞核、核膜及胞浆处,其中核异形性明显的肿瘤细胞的胞核及核膜着色最深,呈均匀的深棕色,胞浆成分较少,着色较浅,呈浅棕色;导管样肿瘤细胞和腺泡样肿瘤细胞主要表达在细胞核的核膜上,呈黄棕色,核内及胞浆着色不均,呈浅黄棕色;肌上皮样肿瘤细胞几乎无表达(图 2～4)。P2Y2受体在 SACC中表达的平均灰度值为 12.73±7.59,高于在正常腺体组织中的表达量,差异具有显著性意义(P＜0.05)(表 1)。

表 1 P2Y 2受体在人正常涎腺组织及SACC中表达量的比较Tab 1The expression of P2Y2 in normal salivary gland and SACC

2.2.1 病理分型：在腺样型 SACC中,P2Y2受体主要表达在筛孔状结构的上皮性肿瘤细胞中,核及核膜着色较深,呈黄棕色,胞浆着色较浅,呈不均匀的浅棕色;形成筛孔状的肌上皮样肿瘤细胞及间质成分几乎无表达(图 2)。在管状型 SACC中,P2Y2受体主要表达在导管内衬样上皮性肿瘤细胞的核膜处,呈黄棕色,核内及胞浆着色不均,呈浅棕色;包绕其周围的肿瘤性肌上皮细胞无表达(图 3)。在实性型 SACC中,P2Y2受体表达在基底细胞样肿瘤细胞的核及核膜中,其中分化较差,核异形性明显的肿瘤细胞着色最深,呈深棕色,胞浆成分少,着色浅,呈不均匀的黄棕色(图 3)。 A1组(腺样 -管状型)和 A2组(实性型)SACC的平均灰度值分别为 8.81±1.31和 20.09±9.01,后者表达量高于前者,差异有显著性意义(P＜0.05)(表 2)。

图1 P2Y 2受体在人正常涎腺组织中免疫组化染色(800×)箭头 a为肌上皮细胞,b为腺泡细胞,c为导管细胞Fig 1 The expression of P2Y2 in normal salivary gland(800×)▲amyoepithelial cell,▲b acinar cell,▲c ductal cell

图2 P2Y2受体在人SACC腺样(筛状)型中免疫组化染色(400×)箭头 a为肌上皮样肿瘤细胞,b为圆型,卵圆形或不规则形肿瘤细胞Fig 2 The expression of P2Y2 in the sieve type of SACC(400×)▲amyoepithelial tumer cell,▲b irregular tumer cell

图3 P2Y2受体在 SACC管状型中的免疫组化染色(400×)箭头 a为肌上皮样肿瘤细胞,b为导管样肿瘤细胞Fig 3 The exp ression of P2Y2 in the tubu lar type of SACC(400×)▲amyoepithelial tumer cell,▲b ductus tumer cell

图4 P2Y2受体在 SACC混合型(腺样,管状,实性)中免疫组化染色(400×)箭头a肌上皮样肿瘤细胞,b为导管样肿瘤细胞,c为体积较小,核异形性明显的肿瘤细胞Fig 4 The expression of P2Y2 in the solid type of SACC(400×)▲amyoepithelial tumer cell,▲b irregular tumer cell,▲c irregular tumer cell.

2.2.2 临床分期：B1组(Ⅰ ～Ⅱ期)SACC以腺样 -管状型为主,肿瘤性肌上皮成分较多;B2组(Ⅲ ～Ⅳ期)SACC以实性基底样肿瘤细胞为主,肌上皮样肿瘤细胞较少。P2Y2受体在二者中表达的平均灰度值分别为 10.33±5.57和 19.49±8.51,后者表达量高于前者,差异有显著性意义(P＜0.05)(表 2)。

2.2.3 神经侵袭情况：在神经受侵的 SACC中,上皮性肿瘤细胞大多排列成团片状或小条索状,P2Y2受体主要表达在上皮性肿瘤细胞的胞核、核膜及胞浆中,侵入和包绕神经纤维的肿瘤细胞着色较深,核及核膜呈深黄棕色,胞浆呈不均匀的黄棕色;肿瘤性肌上皮细胞几乎无表达。受侵袭的神经纤维束中亦有 P2Y2受体的表达。P2Y2受体在 C1组(非神经侵袭型)和 C2组(神经侵袭型)SACC中表达的平均灰度值分别为 10.65±5.34和 18.02±9.78,后者表达量高于前者,差异有显著性意义(P＜0.05)(表2)。

表 2 P2Y2受体在涎腺腺样囊性癌中表达量的比较Tab 2The expression of P2Y2 in SACC

3 讨 论

3.1 ATP受体

自 1929年 Lohmann等发现ATP分子以来,ATP长期被认为是一种重要的能量物质。1953年,Holton等发现神经末梢可以释放 ATP后,对于腺苷酸和腺苷药理学和组织反应方面的报道逐渐增多,ATP作为一种神经递质逐渐被揭示。既然 ATP是一种递质,那么在生物体内必然存在其相应的受体。1978年,Burnstock等发现了嘌呤受体并将其分为P1和 P2受体两大类,P1受体主要的天然配体是腺苷,又称腺苷受体;P2受体是一类 ATP受体,根据组织反应的类型和激动剂作用效力顺序,将其分为P2X(离子通道受体)和 P2Y(G蛋白偶联受体)。迄今已从人体组织细胞克隆出 9种 P2Y受体,分别是P2Y1,2,4,6,11,12,13,14,15受体,空缺的数字是一些仅在非哺乳动物体内发现或功能还不明确的受体[3]。

P2Y受体由 308～377个氨基酸组成,糖基化后分子量为 41～53KD,是一种典型的 G蛋白偶联受体,N端在胞外,C端在胞内,不同的亚型 N、C端有很大差别。P2Y受体在机体内很多组织中均有表达,与其执行的生理功能相适应。

细胞外核苷酸激活 P2Y受体能使血管舒张,心跳减慢;在 P2Y12受体介导下,ADP通过抑制腺苷酸环化酶活性,激活 Ca2+释放,引起血小板聚集效应;P2Y受体家族在调节 Cl-等电解质平衡和维持细胞极性中亦起到重要作用[4];在神经系统中,P2Y4和P2Y12受体可以抑制 M型 K+通道和 N型 Ca2+通道,从而影响动作电位传递以及神经递质释放[5];在脊髓,ADP通过 P2Y1受体介导参与调控中枢运动模式;在免疫系统,免疫细胞表面表达的 P2Y受体可以调节免疫细胞对胞外核苷酸的趋化性[6];P2Y受体还可促进细胞增殖,通过与 ATP的相互作用促进细胞由 G1期到 S期的过渡。因此,进一步研究P2Y受体家族,对促进心血管系统、免疫系统、神经系统的研究,以及对癌症治疗和疾病防治都具有重要意义。

3.2 P2Y2受体在人正常涎腺组织中的表达

研究表明,涎腺腺泡及导管细胞上有多种嘌呤受体亚型,分别介导不同的生理反应[7]。Camden等动物实验证明,如果分离成年动物的大涎腺细胞,进行体外培养,P2Y2受体就会大量增加;将小鼠的颌下腺导管结扎,萎缩的颌下腺组织中 P2Y2受体的表达较正常腺体增加,当将导管结扎解除后,P2Y2受体的表达恢复正常。以上研究说明涎腺组织细胞的损伤修复可能与 P2Y2受体的表达有关。

相关资料报道,在大鼠颌下腺细胞中,P2Y2受体激动剂所致的 Ca2+离子动员以生后早期的反应最大,成年大鼠细胞的反应明显降低,提示 P2Y2受体在大鼠正常涎腺组织细胞中存在发育性改变[8],与大鼠涎腺细胞的分化具有相关性。本实验首次发现了 P2Y2受体在人正常涎腺组织中也有表达,其主要分布在导管细胞的核膜及胞浆处,而分化较好的肌上皮细胞几乎无表达,表明了 P2Y2受体可能与人涎腺组织细胞的分化具有相关性。实验还发现,P2Y2受体在人正常涎腺组织中的表达明显低于在SACC中的表达,两者差别具有非常显著性意义。从涎腺肿瘤的组织发生学来说,SACC主要来自于闰管储备/干细胞,如果说肿瘤细胞是分化障碍和异常的结果,可推测 P2Y2受体可能在 SACC发生机制中发挥一定的作用,这需要进一步的研究。

3.3 P2Y2受体在 SACC中的表达

目前,国内外关于嘌呤受体 P2Y的活化与肿瘤进展之间关系的研究甚少。相关文献报道,P2Y受体在不同活化状态下会产生不同效应,且涉及到多种 MAPK信号传导通路。持续 P2Y受体活化可以抑制前列腺癌细胞的体外生长,其中有细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK 1/2)及 P38激酶通路的参与,并且这种生长抑制程度远大于调亡程度,因而凋亡并非生长抑制的主要因素[9];短暂 P2Y受体活化可抑制前列腺癌细胞集落形成,促进前列腺癌细胞的体外侵袭[10],ERK 1/2通路在其中起重要作用。本研究结果显示,P2Y2受体在实性型 SACC中的表达量明显高于腺样 -管状型中的表达,两者差异具有统计学意义;P2Y2受体在Ⅲ ～Ⅳ期中的表达量明显高于Ⅰ ～Ⅱ期中的表达,两者差异具有统计学意义。因此表明,P2Y2受体的表达与 SACC的恶性程度有关,SACC的恶性程度越高,P2Y2受体的表达量越高,SACC中P2Y2受体表达的高低与肿瘤的恶性程度呈正相关性。但对于 P2Y2受体的活化是否与腺样囊性癌细胞的侵袭和转移相关,以及 MAPK通路是否在此过程中起到重要作用,还有待于进一步的研究。

本实验结果显示,P2Y2受体在 SACC中主要分布在未分化的,体积较小的基底样肿瘤细胞(即分化较差的肿瘤细胞)和导管样肿瘤细胞中,肌上皮样肿瘤细胞中几乎无表达。从分化的角度分析,肿瘤细胞是在分化过程中停止下来的未分化完全的细胞,是分化阻断和分化缺陷的细胞,肿瘤可以被看作为一种分化异常的疾病[11]。肿瘤细胞的本质与正在分化过程中的正常细胞有着一定的相似性,虽然与正常细胞相比较,其分化特征逐渐消失,但仍具备不同程度的分化潜能。所以,癌变后的细胞仍保留一定的分化潜能,具有不同程度的“自发性”分化表现。超微结构和免疫组化证实,SACC由体积较小的未分化细胞,立方形闰管细胞,腺样分泌细胞和梭形肌上皮细胞组成,这几种细胞虽然都是肿瘤细胞,但具有不同的分化程度,其中,肌上皮样细胞是分化较为良好的肿瘤细胞。本次实验结果表明,P2Y2受体的表达可能与 SACC细胞的分化具有相关性。

3.4 P2Y2受体与 SACC神经侵袭的关系

本次实验结果显示,P2Y2受体在神经侵袭型SACC中的表达高于在非神经侵袭型中的表达,两者差别具有统计学意义。分析这一结果,可能有两种原因：①神经受到损伤后,神经纤维束中 P2Y2受体的表达量增加;②P2Y2受体的表达与 SACC细胞的侵袭能力有关,在侵袭能力较强的肿瘤细胞中呈现高表达。

嗜神经生长是腺样囊性癌较为显著的生物学特性之一。近年来,有研究证明[12],神经生长因子在SACC中的表达可能与其具有相关性。神经生长因子的表达是维持涎腺组织正常表型的重要标志,当其恶变为 ACC肿瘤时,ACC肿瘤中肌上皮样肿瘤细胞向雪旺氏样细胞样表型分化,而雪旺氏细胞具有包绕神经生长的特性,肿瘤与神经接触后,通过它们之间的相互作用,进一步使肿瘤表现出雪旺氏细胞的特性,并出现了神经生长因子表达的变化。有关研究证实,在雪旺氏细胞表面具有 P2Y受体的一些亚型分布,主要是 P2Y4和 P2Y6,它们具有调节雪旺细胞内 cAMP水平的功能[13]。可见,P2Y受体的表达可能与 SACC神经侵袭生长的生物学特性有关。已知神经细胞损伤后向胞外释放 ATP,当肿瘤与神经接触后,ATP与 P2Y受体的相互作用是否会影响到 SACC肿瘤细胞的侵袭能力,还有待于进一步的研究。

ATP作为一种传统补充能量物质,已在临床应用多年,具有价格低廉,毒副作用少,安全性高等特点。目前,关于嘌呤受体活化与肿瘤进展关系的研究较少,本课题的完成可为寻找具有新的作用机制的抗癌药物开辟新的研究领域,为进一步探讨涎腺肿瘤基因治疗奠定基础,对于提高腺样囊性癌的治疗水平有重要指导意义。

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Expression o f P2Y2purinocep tor in hum an salivary gland and adenoid cystic carcinom a

GAO Lu1,CHAISong-ling1,ZHANG Fu-yin2
(1.Department of Stomatology,Dalian Medical University,Dalian 116044,China;2.Department of Stomatology,the First Affiliated Hospital of Da lian Medical University,Da lian 116044,China)

[Objective]To study and investigated the clinical significance of P2Y2in salivary adenoid cystic carcinoma(SACC).[Methods]The expression and distribution of P2Y2in 49 SACC and their surrounding salivary tissues were examined with immunohistochemistry,then the gray-scale degreeof P2Y2wasmeasured bym icroscopic analyzing technique.[Results]The average gray scaleof P2Y2in the 49SACC specimens being 12.73±7.59was significantly higher than that of surrounding salivary tissues being 3.76±1.82(P＜0.05).In the SACC,the average scales of P2Y2in the solid type,Ⅲ ～Ⅳ stage and nerve invaded groupswere significantly higher than those in theadenoid-tubular type,Ⅰ ～Ⅱ stage and non-nerve invaded groups,respectively(P＜0.05).[Conclusion]Theexpression of P2Y2is positively correlated tomalignancy of SACC.

salivary adenoid cystic carcinoma;purinoceptor P2Y2;ATP;immunohistochem istry

R 730.2

A

1671-7295(2011)01-0017-06

2010-11-01;

2010-12-08

高 璐(1978-),女,辽宁大连人,讲师,硕士。 E-mail：dygaolu@sina.com

张福胤,教授。E-mail：zhangfuyin@yahoo.com.cn