电刺激小脑顶核对缺氧缺血新生大鼠学习记忆能力的影响

陶德双, 张丽华, 谭丽萍, 杨本利, 李晓红, 王立苹, 孙颖

缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy,H IE)患儿大约有15%～25%死亡,幸存儿中因智力障碍、脑性瘫痪或癫痫而存留永久性神经心理障碍的比例高达25%[1]。其中学习记忆障碍严重影响患儿的生活质量。脑缺血是导致认知障碍的重要原因,缺血性脑损伤诱导基因表达,其中多种基因编码的蛋白质产物直接或间接参与了学习记忆过程的调控,信号转导与转录激活子3(signal transducer and activator of transerip tion l,STAT3)是近年来新发现的一条细胞因子信号转导途径[2]。该途径广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡、调节等过程。STA T3在急性脑缺血损伤中有间接的促凋亡作用。电刺激小脑顶核可通过神经源性保护作用而减轻脑损伤和促进脑功能恢复,作为外源性的干预因素促进内源性神经干细胞的活化和增殖,目前主要用于成人脑损伤的治疗而关于缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain dam age,H IBD)方面报道较少。本研究拟通过动物实验探索电刺激小脑顶核对脑损伤鼠空间学习记忆功能恢复及对STAT3的影响,研究其可能的脑保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 7日龄普通级W istar大鼠(动物合格证号:黑动字第99102001)36只,体质量12～17 g,雌雄不限,由佳木斯大学动物实验中心提供。按随机数字表法分为电刺激组、模型组、假手术组各12只。

1.2 试剂与设备 SP免疫组织化学试剂盒、STAT3单抗(北京博奥森生物工程有限公司);小脑顶核电刺激仪(北京仁和公司);Y-型电迷宫(张家港市生物医学仪器厂);自制常压缺氧箱30 cm×40 cm×50 cm,二端分别有直径约1 cm的进、出气口。

1.3 动物模型制备 新生大鼠H IBD模型的制备与小脑顶核刺激参照经典 Rice法将新生7日龄Wistar大鼠置于含乙醚气体的密闭容器内,吸入麻醉至停止运动后30 s左右取出。仰卧位固定在操作台上,气管正中胸骨上窝偏左上0.5 cm处切1 cm左右的纵切口,分离肌肉、血管、神经,结扎左颈总动脉。手术结束后放回笼内恢复2 h左右。之后将动物放入8%氧气和92%氮气混合气体的低氧舱中,测氧仪监测氧浓度在8.0%±0.1%,持续2 h。结束后放回笼内。假手术组只切开大鼠颈部皮肤并暴露左颈总动脉不结扎,缝合皮肤后不入缺氧舱,母乳常规喂养。

1.4 实验方法 手术第2 d电刺激组即开始电刺激治疗。电刺激仪刺激仔鼠两侧小脑顶核(相当于两侧耳后乳突部),选用强度60 mA,频率136 Hz,每次20 min,每日2次。假手术组和模型组不予电刺激,相应时段仅予抓捉固定。

1.5 观察指标

1.5.1 Y-型迷宫检测 电刺激后,应用Y-型迷宫按照固定次数(20)对大鼠进行学习记忆检测。将大鼠放入迷宫中,随机地将起步区以外的任一臂信号灯打开,使之成为条件信号,经5 s的延时后给不亮灯的两臂及连接区开始通电使之成为非安全区,刺激动物从起步区跑向安全区,当大鼠受电刺激逃到安全区后灯光继续亮30 s,而大鼠逃至安全区灯光继续亮的30 s即为两次测试间的休息时间,熄灯后马上开始第二次测试,大鼠所在支臂就作为下一次测试的起步区,依次重复固定测试20次,以连续20次测试中有18次正确反应为达到学会的标准,记录每一动物迷路分辨学习达到标准前所需要的总时间和主动回避率、正确反应率。

1.5.2 病理观察 各例石蜡包埋组织均取厚5μm切片三张做STAT3免疫组织化学染色,一张用磷酸盐缓冲液代替一抗做阴性对照,采用SP法进行抗STAT3免疫组织化学染色。

1.5.3 图像分析 采用OLYMPUS多功能显微镜自动成像系统及摄像装置采图,每张切片分别于脑皮质和海马区随机选取5个高倍(400倍)视野;应用Image-p ro p lus 6.0图像分析系统对免疫组织化学中神经细胞的STAT3蛋白进行积分光密度(IOD)的测定和分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析,实验全部结束后,整理资料,实验数据以x±s表示。多组均数比较用单因素方差分析,组间两两比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Y-迷宫测试 见表1,2。

表1 刺激7日龄大鼠学习记忆能力的比较( x±s,n=6)

表2 刺激 14日龄大鼠学习记忆能力的比较( x±s),n=6

由表 1,2可见,电刺激 7、14日龄大鼠 Y-迷宫测试,模型组、假手术组总时间较电刺激组增长(P<0.05),电刺激组与假手术组相比增长(P<0.05)。模型组主动回避反应率和正确反应率低于电刺激组(P<0.05),也明显低于假手术组(P<0.01),电刺激组低于假手术组(P<0.05)。7日龄干预组与14日龄干预组相比,三组7日龄总时间较14日龄增长(P<0.05),主动回避率及正确反映率7日龄低于14日龄。

2.2 光镜下脑神经细胞核神经纤维变化 假手术组脑组织各部位的结构及细胞层次清楚、形态正常,核仁核膜明显,大小无变化,神经元无水肿,未见明显损伤性改变;模型组新生大鼠脑组织可见明显的毛细血管出血,可见游离红细胞,细胞核固缩、核碎裂明显,模型建立成功,神经元数量明显减少,正常排列结构消失。电刺激组神经细胞变性坏死较少,多数细胞形态较模型组,相对正常。

2.3 脑皮质和海马区STAT3蛋白的表达STAT3主要分布于缺血侧皮质与海马,结果显示假手术组的缺血侧及对侧前脑均未见到STAT3免疫反应阳性细胞,刺激7、14日龄电刺激组仔鼠脑组织海马STAT3阳性染色细胞IOD与模型组仔鼠相比较,明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。模型组、电刺激组7日龄与14日龄IOD相比明显增加,差异有统计学意义(P<0.01),见表3。

表3 刺激7,14日龄各组大鼠 STAT3的IOD的比较( x±s),n=6

3 讨论

近年关于小脑控制运动的传统观念正在改变。研究发现,小脑某些部位的损伤不是引起运动障碍,而是快速准确地察觉感官信息的功能受损。此外还发现小脑可能在短时记忆、注意等认知、情绪、任务安排和计划能力,乃至精神分裂症和孤独症的成因方面都起着重要作用,电刺激小脑顶核可明显增加大脑血流量,通过抑制经线粒体的细胞编程性死亡而阻断凋亡[3,4],能显著地抑制大鼠脑缺血区的神经元凋亡,减少梗死灶及其周围的白细胞浸润,使氧自由基的产生减少,避免缺血后细胞的死亡,通过神经源性神经保护作用减轻脑损伤和促进脑功能恢复。新生儿缺氧缺血性脑病是引起新生儿急性死亡和慢性神经系统损伤的主要原因之一。长期以来人们一直以为脑和脊髓的神经元是不能再生的。伴随着从胚胎期和成年动物及人脑和脊髓中分离、培养出具有向神经胶质细胞和神经元分化潜能细胞的成功可塑性概念的提出,为中枢神经系统的结构功能重建提供新的手段。但如果仅调动内源性神经干细胞试图修复损伤神经是不够的,所以必须要有外源性的干预因素促进内源性神经干细胞的活化和增殖,来弥补因缺氧缺血损伤而损失的神经细胞,改善脑功能状态[5],因而寻找有效的促进神经干细胞增殖的手段越来越受到重视。

神经损伤后轴突再生是目前研究的热点,信号途径是其重要的组成部分,神经干细胞对神经修复和再生是通过多种信号转导途径实现的[6]。JAKSTAT通路是能够将细胞外信号快速传递至细胞内的信号转导途径,同时启动基因转录,STAT3是JAK-STAT信号通路中的重要成员,其存在是神经系统发育和分化的必要条件。在体内STAT3蛋白还具有参与维持神经细胞的存活和促进神经损伤后的再生、维持c-fos基因基础表达[7,8]。c-fos基因构成学习记忆过程中信号转导的组成部分,在信号转导过程中,及早基因转录翻译的蛋白质作为转录因子,控制基因合成新的蛋白质。研究表明,长时记忆需要新的蛋白质的合成。故可以通过对STAT3进行研究明确JAK-STAT信号通路对脑缺血损伤中学习记忆能力的影响。本结果显示电刺激组仔鼠脑组织海马STAT3阳性染色细胞积分光密度值(IOD)高于模型组,迷宫实验结果也证实电刺激组大鼠认知记忆明显优于模型组。说明电刺激可以通过提高STAT3蛋白的表达,提高学习记忆能力,其机制为通过JAK-STAT信号转导途径增加及早基因表达,合成学习记忆所需新的蛋白质,促进神经再生和神经元存活,从而改善学习记忆能力。本实验在整体动物水平上观察H IBD仔鼠学习能力和工作记忆能力的改善,在神经元的形态结构、亚细胞结构和超微结构上观察由于电刺激小脑顶核的早期干预保护作用导致的形态结构上改变;并在分子水平上探讨了电刺激小脑顶核作用下的H IBD仔鼠海马神经元STAT3蛋白表达的变化及电刺激小脑顶核可能的作用机制,为缺氧缺血脑损伤患儿临床治疗提供理论依据和临床指导。由于大脑学习记忆过程是一个非常复杂的过程,所以对于早期干预有益于学习记忆能力机制的探索值得更加系统、深入地开展。

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