Hedgehog信号通路对胰腺癌细胞上皮间质转化的调控作用

谢昆 田孝东 杨尹默

·综述与讲座·

Hedgehog信号通路对胰腺癌细胞上皮间质转化的调控作用

谢昆 田孝东 杨尹默

Hedgehog(Hh)信号通路及上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)调控细胞的增殖和分化，在胚胎发育过程中均发挥重要作用。正常成人组织中二者活性均明显下降，其异常活化往往与恶性肿瘤的发生、发展、侵袭及转移密切相关。在胰腺癌细胞中常发现有Hh信号通路的异常活化和EMT现象，本文就Hh信号通路调控胰腺癌细胞EMT的作用及其机制做一综述。

一、Hh信号通路与胰腺癌

Hh信号通路主要由分泌型蛋白配体Hedgehog(Hh)、细胞膜受体Patched(Ptc)和Smoothened(Smo)以及转录因子Gli构成，在干细胞自我更新、细胞分化、胚胎发育及组织修复等过程中发挥重要作用[1]。近年研究发现，Hh信号通路在肿瘤发生和发展中起着至关重要的作用，其中的多种基因(Hh、Ptch、Smo及Gli)被视为原癌基因或肿瘤抑制基因，在胰腺癌、基底细胞癌、肝癌、肺癌、髓母细胞瘤及前列腺癌等多种类型的恶性肿瘤中均可观察到Hh信号通路的异常激活[2]。人胰腺癌组织及胰腺癌细胞系中均存在Hh信号通路的异常活化，且与胰腺癌细胞增殖能力相关。应用Hh信号通路特异性阻断剂环巴明(Cyclopamine)在体内外实验中均可显著抑制肿瘤细胞的增殖。

Hh信号通路与胰腺癌的发生存在相关性。Morton等[3]建立了Pdx-Shh转基因小鼠模型，发现异常活化的Hh信号通路可诱导小鼠胰腺发生异常的管状结构，类似人PanIN-1/2的表型结构，这表明Hh信号通路与胰腺癌前病变的发生有着密切关系，同时这些异常的管状结构也含有K-ras基因突变和HER-2/neu的过度表达。Pasca di Magliano等[4]建立了Pdx-1Cre、CLEG2、K-rasG12D转基因动物模型，发现Ras通路和Hh信号通路的同时活化可诱发PanIN病变，并在早期形成胰腺癌，证明Hh和Ras通路在胰腺癌发生的早期阶段共同发挥重要作用。研究认为，Hh信号通路主要参与细胞周期的调控，通过促进胰腺肿瘤细胞增殖和抑制凋亡发挥作用。同时有研究显示，Hh信号通路还与Wnt、Notch、TGF-β及EGFR等多个肿瘤相关的信号通路存在着广泛的交互作用[5-6]。

Hh信号通路亦参与胰腺癌的侵袭、转移过程。Feldmann等[7]报道，Gli1的过度表达导致胰腺癌细胞侵袭性和转移性增高。使用环巴明后，肿瘤的侵袭能力明显减弱，接受环巴明治疗的7只种植肿瘤小鼠中，只有1只出现肺的微转移灶，而未给药组小鼠全部出现肉眼可见的转移灶。环巴明和吉西他滨联合给药组所有小鼠均未出现转移灶，并显著缩小了原发肿瘤的大小，表明抑制Hh信号通路能显著抑制胰腺癌的生长、侵袭及转移[8]。

二、EMT在胰腺癌侵袭、转移中的作用

EMT是指在某些特殊的生理或病理条件下具有极性的上皮细胞失去极性，转换成具有迁移能力、能够在细胞基质间自由移动的间质细胞的过程[9]。EMT以上皮细胞极性的丧失及间质特性的获得为重要特征，同时细胞表型发生改变，E-钙粘素(E-cadherin)、细胞角蛋白(Cytokeratin)、α-连环素(α-catenin)、β-连环素(β-catenin)、γ-连环素(γ-catenin)、桥粒斑蛋白、紧密连接蛋白、黏蛋白等上皮表型标志物逐渐丧失，而波形蛋白(Vimentin)、纤维连接蛋白(Fibronectin)、N-钙粘素(N-cadherin)、α-平滑肌动蛋白(α-SMA)等间质表型的表达上调。在胰腺的胚胎发育期，EMT在胰腺内分泌细胞形成胰岛的过程中有着重要作用[10]。此外，在创伤修复的生理过程中，EMT也极为活跃[11]。

目前广泛认为，黏附分子E-cadherin表达的变化在EMT过程中有着至关重要的作用[12]。E-cadherin的分子之间通过细胞外的免疫球蛋白结构域相互形成链接，并通过胞质内的α、β-catenin与肌动蛋白骨架相连，可以形成稳定的细胞间接触；其表达减少，可导致细胞间连接解体，细胞分散，角蛋白为主的细胞骨架转变为波形蛋白为主的细胞骨架，E-cadherin逐渐被N-cadherin所取代，细胞骨架的重排引起细胞表型的改变，细胞运动能力增强。

EMT是上皮来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，失去了与基底膜的连接等上皮表型，获得了具有较高迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质等能力的间质表型。从而使肿瘤形成局部浸润和远处转移，并再次通过间质-上皮转化(mesenchymal-epithelial transition，MET)定植形成转移灶。近来有很多研究证实，在包括结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌及宫颈癌等多种肿瘤侵袭转移的过程中均观察到EMT的发生，而且肿瘤组织中发生EMT的肿瘤细胞数量直接与其侵袭转移程度有关[13-14]。

近年来研究发现，Twist、Snail、Slug、Sip1及NF-κB等多种转录因子的表达均可以促进EMT，在肿瘤细胞的转移中起着重要作用。其中Snail是最重要的EMT诱导因子，Snail(Snai1)和Slug(Snai2)都属于锌指蛋白Snai超家族，它们含有锌指结构的DNA结合蛋白，可以识别并与E-cadherin启动子部位的E-box结合，抑制E-cadherin的表达，上调FSP1、Vimentin和Rho等表达，促进EMT的发生[15]。Snail高表达的恶性肿瘤多分化较差、侵袭能力较强、易发生转移和复发，被认为是一个反映恶性肿瘤预后不良的重要生物学标记物。Twist属于碱性螺旋-环-螺旋蛋白家族，是一个高度保守的转录因子，可以调节胚胎发育中的组织重建，并赋予细胞迁徙的能力。研究发现，Twist也可与E-box序列结合，下调E-cadherin和β-catenin等黏附连接蛋白表达，激活间质标记物，从而促进EMT的发生[16]。NF-κB可与Vimentin基因启动子调节序列结合，并促进Twist表达，诱导EMT的发生。NF-κB还可以上调ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox 1)的表达，ZEB1可抑制多种重要的上皮分化和细胞黏附因子，抑制E-cadherin的表达，诱导EMT发生[17]。Maier等[18]在乳腺癌模型的研究证明，在诱导和维持EMT的过程中，NF-κB信号通路是必需的；抑制NF-κB可以阻止EMT的发生。相反，激活NF-κB则可以促进上皮细胞向间质细胞转变。Sip1也是一种锌指蛋白，也可以抑制E-cadherin的表达，与Snail的结合序列有部分重叠。在某些E-cadherin缺失的人类癌细胞系中，Sip1呈高表达；另外，某些E-cadherin启动子高度甲基化的细胞系亦高表达Sip1[19]。

许多信号转导通路也参与EMT的调节，包括Ras、Wnt、Notch、Hedgehog、Rho家族激酶及TGF-β、生长因子受体等[20]。目前认为，肿瘤细胞发生EMT是微环境中作用因子和肿瘤细胞相互作用的结果，作用因子通过与细胞表面特异受体结合而将细胞外信号转入细胞内，通过胞内的Ras、Wnt、Hh、Notch、TGF-β和生长因子受体等信号转导途径，活化Snail、Twist等核内转录因子，调节下游基因的表达，最终使肿瘤细胞更富于侵袭性而利于进一步发生转移。

EMT过程与胰腺癌的侵袭、转移密切相关。Nakajima等[21]研究发现，胰腺癌组织中N-cadherin表达明显上调，在原发肿瘤部位和肝转移灶中表达率分别为43.3%(13/30)和53.3%(8/15)，其表达与肿瘤神经浸润显著相关，而Vimentin则主要表达在肝转移灶中。此外，很多研究发现EMT过程与胰腺癌干细胞关系密切。Dembinski等[22]在分离出的DiI+/SCC细胞群，Kabashim等[23]在SP细胞亚群均发现存在明显增强的EMT过程，认为EMT现象与肿瘤干细胞侵袭性增加相关。

三、Hh信号通路调控胰腺癌细胞EMT的作用及机制

Hh信号通路介导EMT发生的机制目前虽不甚明确，但研究表明两者之间有一定的相关性。研究发现，EMT过程中的重要转录因子Snail可能为Gli1蛋白的下游转录调控靶点。Li等[24]在皮肤癌的研究中发现Hh信号转导通路中的下游转录因子Gli水平的升高可迅速上调Snail的表达，Snail可进一步介导E-cadherin表达水平下调，促进EMT的发生。Feldmann等[7]胰腺癌的研究中也报道Hh通路下游因子Gli1过度表达，可促进Snail的表达上调，使E-cadherin表达明显下调，促进EMT的发生，导致肿瘤细胞侵袭性和转移性增高；使用环巴明后，Snail水平明显下调，而E-cadherin表达水平明显上调，肿瘤的侵袭能力明显减弱。

EMT相关转录因子Sip1的启动子区域也具有Gli1蛋白的转录调控DNA结合位点。Ohta等[25]使用小干扰RNA技术沉默Gli1后胃癌的Sip1蛋白的表达相应下调，但并未发现Sip1可下调EMT过程中的重要蛋白E-钙粘素(CDH1基因)的表达。然而目前尚无证据表明胰腺癌细胞中Hh信号通路可直接调控Sip1表达进而调控EMT过程。

Li等[26]报道，Hh信号转导通路的异常活化可迅速上调Wnt家族如Wnt2b、Wnt7b等的表达，间接激活Wnt通路，与Snail协同作用于β-catenin，破坏E-cadherin-β-catenin复合物，并抑制蛋白激酶GSK-3β对β-catenin的降解作用，使β-catenin在细胞内积聚并重新定位，从细胞膜上解离进入细胞核内，与核内转录因子相互作用，调节下游靶基因的表达水平，导致细胞黏附力下降，细胞浸润转移能力增强，促进EMT的发生。另有研究表明，Hh与Wnt、Notch、Ras、TGF-β及生长因子受体等与EMT发生关系密切的信号转导通路均存在协同交互作用[5,7]。近年研究发现，Hh信号通路及EMT过程均在肿瘤干细胞的形成及其生物学特性的维持中有着重要作用。Dembinski等[27]发现，CD24+/CD44+，CD133+并表达ALDH的胰腺癌肿瘤干细胞中均有Hh信号通路高表达，而且这类细胞EMT现象较其他胰腺癌肿瘤细胞明显增强，E-cadherin表达显著下调，而Twist、N-cadherin、Vimentin及MMP-2的表达均明显上调。但是在肿瘤干细胞的形成及其生物学特性的维持过程中，Hh信号通路及EMT是否存在相互作用及其作用机制仍有待进一步研究证实。

总之，Hh信号通路可通过介导其下游转录因子Snail的表达、下调E-cadherin的表达来直接介导胰腺癌细胞EMT的发生；也可能通过与Wnt/β-catenin等信号转导通路的交互作用间接介导EMT的发生；抑制Hh信号转导通路可明显抑制胰腺癌细胞EMT的发生，进而使肿瘤的侵袭和转移能力减弱。进一步深入研究Hh信号通路调控胰腺癌细胞EMT的作用机制，将为肿瘤的治疗寻找新的切入点及新的药物作用靶点提供方向。

[1] Hezel AF, Kimmelman AC, Stanger BZ, et al. Genetics and biology of pancreatic ductal adenocarcinoma. Genes Dev, 2006,20:1218-1249.

[2] Barakat MT, Humke EW, Scott MP. Learning from Jekyll to control Hyde: Hedgehog signaling in development and cancer. Trends Mol Med, 2010,16:337-348.

[3] Morton JP,Mongeau ME, Klimstra DS, et al. Sonic hedgehog acts atmultiple stages during pancreatic tumorigenesis. Proc NatlAcad Sci USA, 2007, 104:5103-5108.

[4] Pasca di Magliano M, Sekine S, Ermilov A, et al. Hedgehog/Ras interactions regulate early stages of pancreatic cancer. Genes Dev, 2006, 20:3161-3173.

[5] Dennler S, André J, Alexaki I, et al. Induction of sonic hedgehog mediators by transforming growth factor-β: Smad3-dependent activation of Gli2 and Gli1 expression in vitro and in vivo. Cancer Res, 2007, 67:6981-6986.

[6] Stecca B, Mas C, Clement V, et al.Melanomas require HEDGEHOG-GLI signaling regulated by interactions between GLI1 and the RAS-MEK/AKT pathways. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104:5895-5900.

[7] Feldmann G, Dhara S, Fendrich V, et al. Blockade of hedgehog signaling inhibits pancreatic cancer invasion and metastases a new paradigm for combination therapy in solid cancers.Cancer Reserch, 2007, 67:2187-2196.

[8] Katoh Y, Katoh M. Hedgehog signaling, epithelial-to-mesenchymal transition and miRNA. Int J Mol Med, 2008, 22:271-275.

[9] Savagner P. The epithelial-mesenchymal transition (EMT) phenomenon. Ann Oncol, 2010,21:vii89-vii92.

[10] Cates JM, Byrd RH, Fohn LE, et al. Epithelial-mesenchymal transition markers in pancreatic ductal adenocarcinoma. Pancreas, 2009,38:e1-e6.

[11] Arnoux V, Nassour M, L′ Helgoualc′h A,et al. Erk5 controls Slug expression and keratinocyte activation during wound healing. Mol Biol Cell, 2008, 19:4738-4749.

[12] Chao YL, Shepard CR, Wells A. Breast carcinoma cells re-express E-cadherin during mesenchymal to epithelial reverting transition. Mol Cancer, 2010, 9:179.

[13] Guarino M. Epithelial-mesenchymal transition and tumour invasion. Int J Biochem Cell Biol, 2007, 39:2153-2160.

[14] Prall F. Tumour budding in colorectal carcinoma. Histopathology, 2007, 50:151-162.

[15] Olmeda D, Moreno-Bueno G, Flores JM, et al. SNAI1 is required for tumor growth and lymph node metastasis of human breast carcinoma MDA-MB-231 cells. Cancer Res, 2007, 67:11721-11731.

[16] Hotz B, Arndt M, Dullat S, et al. Epithelial to mesenchymal transition: expression of the regulators snail, slug, and twist in pancreatic cancer. Clin Cancer Res, 2007,13:4769-4776.

[17] Chua HL,Bhat-Nakshatri P,Clare SE,et al.NF-kappaB represses E-cadherin expression and enhances epithelial to mesenchymal transition of mammary epithelial cells:potential involvement of ZEB-1 and ZEB-2.Oncogene,2007,26:711-724.

[18] Maier HJ, Schmidt-Strassburger U, Huber MA, et al. NF-kappaB promotes epithelial-mesenchymal transition, migration and invasion of pancreatic carcinoma cells. Cancer Lett, 2010,295:214-228.

[19] Mejlvang J, Kriajevska M, Vandewalle C, et al.Direct repression of cyclin D1 by SIP1 attenuates cell cycle progression in cells undergoing an epithelial mesenchymal transition. Mol Biol Cell, 2007,18:4624.

[20] Huber MA, Kraut N, Beug H. Molecular requirements for epithelial-mesenchymal transitionduring tumor progression. Curr Opin Cell Biol, 2005, 17:548-558.

[21] Nakajima S, Doi R, Toyoda E, et al. N-cadherin expression and epithelial-mesenchymal transition in pancreatic carcinoma. Clin Cancer Res, 2004,10:4125-4133.

[22] Dembinski JL, Krauss S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin Exp Metastasis, 2009,26:611-623.

[23] Kabashima A, Higuchi H, Takaishi H, et al. Side population of pancreatic cancer cells predominates in TGF-beta-mediated epithelial to mesenchymal transition and invasion. Int J Cancer, 2009,124:2771-2779.

[24] Li X, Deng W, Nail CD, et al. Snail induction is an early response to Gli1 that determines the efficiency of epithelial transformation. Oncogene, 2006, 25: 609-621.

[25] Ohta H, Aoyagi K, Fukaya M, et al. Cross talk between hedgehog and epithelial-mesenchymal transition pathways in gastric pit cells and in diffuse-type gastric cancers，Br J Cancer, 2009, 100:389-398.

[26] Li X, Deng W, Lobo-Ruppert SM, et al. Gli1 acts through Snail and E-cadherin to promote nuclear signaling by beta-catenin. Oncogene, 2007, 26:4489-4498.

[27] Dembinski JL, Krauss S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin Exp Metastasis, 2009, 26:611-623.

2011-01-04)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.024

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